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找到 关键词 包含"基因转染" 49条结果
  • 体外Akt基因转染对骨髓间充质干细胞葡萄糖转运载体-4表达和易位的影响

    目的 探讨葡萄糖转运载体(GLUT)-4是否参与骨髓间充质干细胞(MSCs)的葡萄糖转运以及Akt基因转染提高MSCs耐缺氧能力是否与GLUT-4易位和表达有关。方法 将经Akt基因转染和未转染的MSCs均行常氧(5% CO2)和缺氧(94% N2、1%O2和5%CO2)37 ℃孵育8 h。放射同位素法检测氚标-脱氧葡萄糖(3H-G)的摄取量,免疫细胞化学染色、Western blot和RT-PCR分别检测GLUT-4的蛋白质和mRNA表达。结果 ①缺氧转染组的3H-G摄取量是缺氧非转染组的(1.39±0.13)倍(P<0.05),但仍低于常氧非转染组(P<0.05)。②MSCs在常氧或缺氧、Akt基因转染或无转染的条件下均可表达GLUT-4蛋白。与常氧非转染组比较,缺氧非转染组GLUT-4 mRNA和蛋白的表达水平明显降低(P<0.05)。③与缺氧非转染组比较,缺氧转染组的GLUT-4 mRNA〔(1.756±0.152)倍〕和蛋白〔细胞总GLUT-4蛋白(1.653±0.312)倍,细胞膜GLUT-4蛋白(2.041±0.258)倍〕的表达水平明显提高(P<0.05),且GLUT-4蛋白易位明显; 但与常氧非转染组比较,其GLUT-4 mRNA和蛋白的表达水平仍较低(P<0.05)。④MSCs的3H-G摄取量与细胞膜中GLUT-4蛋白的表达呈正相关(r=0.415,P=0.001)。结论 GLUT-4可能参与MSCs的葡萄糖转运,Akt基因提高MSCs耐缺氧能力可能与提高GLUT-4的表达和易位有关。

    发表时间:2016-09-08 10:50 导出 下载 收藏 扫码
  • 运用siRNA建立稳定低表达IGF1R基因的肝癌细胞株的实验研究

    目的 运用siRNA技术在肝癌细胞株中建立稳定低表达人胰岛素样生长因子1类受体(IGF1R)基因的细胞株。方法 构建包含封闭IGF1R基因的真核表达载体pSUPER-IGF1R-siRNA,转染SMMC7721和Hep3B细胞,G418筛选表达稳定的细胞株。通过RT-PCR、Western-blot分析与鉴定IGF1R mRNA和蛋白及cyclin D1、cyclin B1蛋白的表达,并绘制细胞生长曲线。结果 在SMMC7721和Hep3B细胞中成功建立低表达IGF1R基因的细胞株,其生长明显减慢(P<0.05),且其cyclin D1表达亦明显下降(P<0.05)。结论 pSUPER-IGF1R-siRNA能抑制SMMC7721和Hep3B细胞的生长。

    发表时间:2016-08-28 04:08 导出 下载 收藏 扫码
  • 腺病毒介导的鼠内皮抑素基因转染肺癌细胞体外抑制血管内皮细胞活性的实验研究

    目的 测定携带小鼠内皮抑素( mES )基因的腺病毒( Ad-mES )在肿瘤细胞中的表达,观察 mES 对体外培养的血管内皮细胞的抑制作用。方法 分别以0.01、0.1、1、10及100共5个不同感染复数(MOI)的Ad-mES转染Lewis肺癌细胞株(LLC)。采用免疫组织化学法及Western blot检测Ad-mES转染LLC 48 h后mES蛋白的表达;应用四甲基偶氮唑蓝比色(MTT)分析法测定不同MOI值Ad-mES转染上清对基础状态下及经碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)刺激的人脐静脉内皮细胞(ECV304)的增殖抑制作用。结果Ad-mES转染LLC 48 h后,LLC细胞浆内可见棕黄色mES阳性表达颗粒,培养上清可表达位于相对分子质量20 000的mES阳性条带,而未转染对照组呈阴性。随转染Ad-mES MOI值的增高,培养上清基础条件下及经bFGF刺激的内皮细胞的抑制作用越显著(与基础条件下比较,Plt;0.05)。结论 构建的Ad-mES转染LLC后能够表达分泌mES;表达分泌于培养上清中的mES对血管内皮细胞(尤其是bFGF刺激)具有明显的增殖抑制作用。

    发表时间:2016-09-14 11:56 导出 下载 收藏 扫码
  • hVEGF165/pcDNA3.1在小鼠心肌细胞中的表达

    目的观察重组质粒人血管内皮生长因子165基因与质粒载体pcDNA3.1的重组体(hVEGF165/pcDNA3.1)在心肌细胞中的表达,为冠心病的基因治疗和细胞移植治疗研究奠定基础。方法体外培养小鼠心肌细胞,脂质体介导hVEGF165/pcDNA3.1转染心肌细胞,用逆转录-聚合酶链反应(RT—PCR)、细胞免疫化学方法和免疫印迹法(Western blotting)检测其在心肌细胞中的瞬时表达。结果RT—PCR扩增得到与hVEGF165大小一致的目的条带,细胞免疫化学法检测到心肌细胞胞质中hVEGF蛋白,Western blotting在培养的细胞上清液中检测到hVEGF蛋白。结论构建的重组质粒hVEGF165/pcDNA3.1能在体外培养的小鼠心肌细胞中表达,可用于冠心病的基因和细胞移植治疗研究。

    发表时间:2016-08-30 06:22 导出 下载 收藏 扫码
  • 外源性p16基因对食管癌患者癌细胞系的生长抑制作用

    目的 观察外源性p16基因质粒导入食管癌患者食管鳞癌细胞系Ec109后的表达及其对Ec109细胞增殖生长状况的影响。方法 根据转染质粒的不同或是否行p16 cDNA质粒转染分为三组,每组分别为5个样本。PcDNA3-P16转染组(P16转染组):采用脂质体(Lipofectamine)为载体,将PcDNA3-P16表达质粒导入Ec109细胞;空载体转染组:用PcDNA3-neo空载体以上述相同方法转染,作空白对照;未转染组:未用PcDNA3-P16质粒转染,作阴性对照。应用Northern斑点杂交、免疫组织化学、免疫荧光检测转化细胞的P16蛋白变化;流式细胞仪分析细胞周期变化,DNA片段化电泳检测细胞凋亡。结果 P16转染组外源性p16基因在Ec109细胞中表达后,细胞生长速度减慢,克隆形成能力下降,瞬时表达时有细胞凋亡发生,稳定表达后细胞存在G1期阻滞;空载体转染组和未转染组均未观察到以上结果。结论 脂质体介导的外源性p16基因转染对Ec109细胞有生长抑制作用,p16基因瞬时表达可诱导细胞凋亡。

    发表时间:2016-08-30 06:34 导出 下载 收藏 扫码
  • 人胶质细胞源性神经营养因子基因修饰猴雪旺细胞的构建与鉴定

    目的构建人胶质细胞源性神经营养因子(human glial cell derived neurotrophic factor,hGDNF)基因修饰的猴雪旺细胞稳定细胞系。 方法以pUC19-hGDNF为模板,扩增含hGDNF基因序列,将其插入质粒pBABE-puro,构建pBABE-puro-hGDNF重组真核表达载体,经酶切鉴定及DNA测序鉴定重组质粒。从恒河猴提取、培养、纯化雪旺细胞。包装病毒,利用含hGDNF基因的重组逆转录病毒转染雪旺细胞,实时荧光定量PCR、Western blot检测hGDNF mRNA及蛋白表达情况。 结果PCR产物hGDNF基因编码序列大小约596 bp。重组表达载体经双酶切鉴定,含有1 条596 bp的特异性条带,其基因测序结果与基因库中hGDNF基因序列片段相同,提示hGDNF基因成功转入逆转录病毒。逆转录病毒转染的雪旺细胞hGDNF mRNA及蛋白表达量显著高于未转染雪旺细胞,差异有统计学意义(P lt; 0.05)。 结论成功构建hGDNF基因修饰的猴雪旺细胞稳定细胞系,能长期稳定高效释放hGDNF,为进一步将其应用于神经损伤修复奠定了基础。

    发表时间:2016-08-31 04:05 导出 下载 收藏 扫码
  • 人BMP-4腺病毒表达载体对人退变腰椎间盘细胞的影响

    目的研究人BMP-4腺病毒表达载体(adenovirus human BMP-4,Ad-hBMP-4)转染体外培养人退变腰椎间盘细胞后,对细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Sox9表达的影响。 方法取Ad-hBMP-4重组腺病毒进行扩增,并检测病毒滴度。取Modic Ⅲ级、27~50岁腰椎间盘突出症患者自愿捐赠的退变椎间盘体外分离、培养椎间盘细胞,激光共聚焦显微镜观察Ⅱ型胶原在细胞中的表达。取第1代椎间盘细胞转染Ad-hBMP-4重组腺病毒(实验组),应用RT-PCR和Western blot法分别检测病毒转染后3、6 d细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原、Sox9基因及蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白的表达,与未转染细胞(对照组)进行比较。 结果Ad-hBMP-4重组腺病毒滴度为5 × 106 PFU/mL。激光共聚焦显微镜观察示Ⅱ型胶原主要表达于椎间盘细胞质。Ad-hBMP-4重组腺病毒转染后细胞形态无明显变化。转染3、6 d后实验组蛋白多糖、Ⅱ型胶原、Sox9 mRNA表达以及蛋白多糖、Ⅱ型胶原蛋白表达均显著高于对照组,比较差异有统计学意义(P lt; 0.05);实验组各指标3、6 d间比较差异亦有统计学意义(P lt; 0.05)。 结论Ad-hBMP-4可有效转染体外培养人退变椎间盘细胞,促进细胞蛋白多糖、Ⅱ型胶原及Sox9表达,提示hBMP-4可能对早期退变的椎间盘具有修复功能。

    发表时间:2016-08-31 04:22 导出 下载 收藏 扫码
  • 腺病毒介导BMP-2联合低氧诱导因子1α突变型与单基因BMP-2分别转染BMSCs后成骨效应的比较研究

    目的 比较腺病毒载体Ad-BMP-2-内部核糖体进入位点(internal ribosome entry site,IRES)-低氧诱导因子1α突变型(hypoxia inducible factor 1αmu,HIF-1αmu)与Ad-巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)-BMP-2-IRES-人源化海肾绿色荧光蛋白1(human renilla reniformis green fluorescent protein 1,hrGFP-1)分别转染BMSCs后的成骨效应,优化成骨细胞种子来源。 方法取1月龄新西兰大白兔骨髓分离培养BMSCs。取第3代BMSCs进行病毒液转染,根据转染病毒液不同将实验分为4组,A、B、C组分别采用感染复数(multiplicity of infection,MOI)为50、100、150和200的Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu、Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1、Ad-CMV-IRES-hrGFP-1(空腺病毒载体)转染细胞,D组为未被转染的BMSCs。选择最佳MOI值进行观察。转染后采用免疫组织化学染色检测BMP-2表达,Western blot检测BMP-2和HIF-1α蛋白表达,ALP活性测定和钙结节茜素红染色检测细胞成骨分化能力。 结果A、B、C组最佳MOI值分别为200、150和100。免疫组织化学染色示,A、B组BMP-2染色呈阳性,C、D组呈阴性;A组阳性细胞数明显多于B组(P lt; 0.05)。Western blot检测示,A、B组BMP-2蛋白表达明显高于C、D组(P lt; 0.05),A组高于B组(P lt; 0.05);A组HIF-1α蛋白表达明显高于其余3组(P lt; 0.05),其余3组间差异无统计学意义(P gt; 0.05)。A、B组ALP活性明显高于C、D组(P lt; 0.05),A组高于B组(P lt; 0.05)。茜素红染色示,A、B组可见明显钙结节,C、D组未见钙结节形成;且A组钙结节数量多于B组(P lt; 0.05)。 结论单载体双基因Ad-BMP-2-IRES-HIF-1αmu与单载体单基因Ad-CMV-BMP-2-IRES-hrGFP-1分别转染兔BMSCs后,前者BMP-2和成骨效应表达均高于后者。

    发表时间:2016-08-31 05:39 导出 下载 收藏 扫码
  • 人基质细胞衍生因子1α 和hVEGF165 基因转染成肌细胞的实验研究

    目的 探索转染hVEGF165 基因、人基质细胞衍生因子1α(human stromal cell-derived factor 1α,hSDF- 1α)基因的大鼠成肌细胞在体外mRNA 和蛋白表达,为进一步检测这两种基因对血管生成的协同效应奠定基础。 方法 取新生1 日龄雄性SD 大鼠,采用胰蛋白酶消化法体外分离培养、纯化成肌细胞,并采用结蛋白免疫细胞化学染色鉴定。将质粒增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)-hVEGF165 和EGFP-hSDF-1α 转染第3 代成肌细胞(转染组),以未转染质粒的细胞作为对照组。体外培养后各时间点行RT-PCR、Western blot、ELISA 法检测两种质粒mRNA 及蛋白的表达。 结果 培养的细胞经鉴定确定为成肌细胞。荧光显微镜观察示成功转染hSDF- 1α和hVEGF165 进入成肌细胞,可见绿色荧光表达。RT-PCR 检测示转染组转染后2、4、6、8 d 均可见hVEGF165 和hSDF- 1αmRNA 的表达,Western blot 检测示转染组转染后2、4、6、8 d 成肌细胞内均有hVEGF165 和hSDF-1α 蛋白表达,对照组均无相关表达。ELISA 检测示对照组hSDF-1α 和hVEGF165 均稳定表达,呈较低水平。转染组转染2 d 时hSDF-1α 和hVEGF165 表达均达较高水平,之后呈逐渐下降趋势;转染后各时间点间hSDF-1α 和hVEGF165 表达比较差异均有统计学意义(P lt; 0.05)。转染组转染后各时间点与对照组比较差异均有统计学意义(P lt; 0.05)。 结论 转染hSDF-1α 和hVEGF165 进入大鼠成肌细胞后在体外均有表达,为下一步研究体内是否表达提供了实验依据。

    发表时间:2016-08-31 05:42 导出 下载 收藏 扫码
  • hBMP-7 基因在脂肪源性干细胞中的表达及对其向成骨细胞分化的影响

    目的 构建hBMP-7 基因真核表达载体,观察其在兔脂肪源性干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)的表达,并观察其对ADSCs 向成骨细胞分化的影响。 方法 3 月龄清洁级健康日本大耳白兔,雌雄不限,体重3 ~ 4 kg。取兔皮下脂肪约5 mL,采用胶原酶消化离心贴壁培养法培养 ADSCs,取第3 代细胞进行实验;CD44、CD49d、CD106 免疫荧光染色鉴定ADSCs。构建真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-7,经鉴定后利用LipofectamineTM 2000 介导转染ADSCs,免疫组织化学染色检测hBMP-7 在ADSCs 中的表达;ALP 定量测定、Ⅰ型胶原免疫荧光检测hBMP-7 基因转染对ADSCs 向成骨细胞分化的影响。 结果 倒置相差显微镜观察示ADSCs 呈梭形、多角形分布;表面抗原标志CD44、CD49d 呈阳性表达,CD106 呈阴性表达。成功构建pcDNA3.1-hBMP-7 真核表达载体,并利用脂质体介导的方法成功导入ADSCs 中,免疫组织化学染色提示hBMP-7 能在ADSCs 中表达。ALP 定量测定示,转染后7、10、14 d pcDNA3.1-hBMP-7 转染组(实验组)ALP 活性明显高于pcDNA3.1 空载体转染组(对照组),差异有统计意义(P lt; 0.05);转染后7、14 d,实验组Ⅰ型胶原表达量均高于对照组(P lt; 0.05)。 结论 构建的真核表达载体pcDNA3.1-hBMP-7 可在兔ADSCs中表达,且转染后的ADSCs ALP 定量测定、成骨标志物Ⅰ型胶原的表达均高于pcDNA3.1 空载体转染细胞,为开展以干细胞为载体的局部基因治疗奠定了基础。

    发表时间:2016-08-31 05:44 导出 下载 收藏 扫码
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