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  • H2O2 下调 miR-21 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化影响的研究

    目的探讨 H2O2 诱导的 miR-21 下调对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的作用及机制。方法取 MC3T3-E1 细胞系,培养传至第 7 代进行实验。取 MC3T3-E1 细胞,以不同浓度 H2O2(0、40、80、160、320 μmol/L)培养,经实时荧光定量 PCR 检测 miR-21 表达、MTS 法检测细胞活性,选择 H2O2 最合适实验浓度。取 MC3T3-E1 细胞分为空白对照组(A 组)、H2O2 组(B 组)、成骨诱导组(C 组)、H2O2+成骨诱导组(D 组),对应培养后实时荧光定量 PCR 检测 miR-21 表达以及成骨标志基因 Runx2、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)及Ⅰ型胶原蛋白(collagen type Ⅰ alpha 1,Col1a1)表达,Western blot 检测磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog,PTEN)蛋白表达,茜素红染色观察细胞外钙基质沉积情况,分析 H2O2 对 MC3T3-E1 细胞成骨分化的影响。然后再取 MC3T3-E1 细胞,分为 H2O2 组(A1 组)、H2O2+成骨诱导组(B1 组)、H2O2+miR-21 抑制剂+成骨诱导组(C1 组)、H2O2+miR-21 抑制剂阴性对照+成骨诱导组(D1 组);以及 H2O2 组(A2 组)、H2O2+成骨诱导组(B2 组)、H2O2+siRNA-PTEN 阴性对照+成骨诱导组(C2 组)、H2O2+siRNA-PTEN+成骨诱导组(D2 组);对应培养后检测成骨标志基因(Runx2、OPN、Col1a1)表达以及细胞外钙基质沉积情况,分析下调 miR-21 或沉默 PTEN 对细胞成骨分化的影响。结果结合实时荧光定量 PCR 检测以及 MTS 法结果,选择 160 μmol/L H2O2 进行实验。第 1、2 周 B 组 miR-21 相对表达量低于 A 组(P<0.05),D 组低于 C 组(P<0.05);第 2 周 C 组 PTEN 蛋白相对表达量均低于 A、D 组(P<0.05);第 1、2 周 D 组 Runx2、OPN 及 Col1a1 mRNA 相对表达量均低于 C 组(P<0.05),茜素红染色显示 D 组钙基质沉积少于 C 组。C1 组 PTEN 蛋白相对表达量高于 D1 组(P<0.05);第 1、2 周 B1、D1 组 Runx2、OPN mRNA 相对表达量均高于 C1 组(P<0.05),第 2 周 B1、D1 组 Col1a1 mRNA 均高于 C1 组(P<0.05);茜素红染色显示 C1 组钙基质沉积少于 B1、D1 组。第 1 周 D2 组 OPN、Col1a1 mRNA 相对表达量高于 B2、C2 组(P<0.05),第 3 周茜素红染色显示 D2 组钙基质沉积明显多于 B2、C2 组。结论H2O2 抑制 MC3T3-E1 成骨分化可能与 miR-21 下调有关。

    发表时间:2018-03-07 04:35 导出 下载 收藏 扫码
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