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找到 作者 包含"王琴梅" 2条结果
  • 载基因脂多糖胺纳米囊泡诱导BMSCs定向成骨分化

    目的 制备并优化阳离子载体脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs)性能,探讨其负载靶基因后体外诱导 BMSCs 定向成骨分化能力。 方法 采用接枝共聚的方法合成 LNPs,探讨合成时不同 pH(7.5、8.0、8.5、9.0)对 LNPs 及 LNPs/pBMP-2-绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)复合物理化性能的影响;通过体外大鼠 BMSCs 细胞毒性及转染实验,筛选出具低毒高转染效能的 LNPs,再用其负载 pBMP-2-GFP 基因转染大鼠 BMSCs,通过定期观察细胞形态、测定细胞表达 BMP-2 蛋白水平和 ALP 活性、钙结节生成情况来评价 LNPs/pBMP-2-GFP 对 BMSCs 成骨分化的影响。 结果 pH 为 8.5 时合成的 LNPs 含氮量、粒径及 zeta 电位均低于其余 pH 值组,其细胞毒性最低(细胞成活率 96.5%±1.4%)、转染效率最高(98.8%±0.1%)。BMSCs 经 LNPs/pBMP-2-GFP 转染诱导处理后,在前 4 d 内,其 BMP-2 蛋白表达量均明显高于 Lipofectamine2000(Lipo)/pBMP-2-GFP 组、支链型聚乙烯亚胺 25K/pBMP-2-GFP 组和空白对照组(P<0.05)。诱导后 14 d 其 ALP 活性高于 Lipo/pBMP-2-GFP 组和空白对照组(P<0.05),与成骨诱导液处理组相当(P>0.05);茜素红染色显示其和成骨诱导液处理组细胞出现明显钙结节,而 Lipo/pBMP-2-GFP 组和空白对照组细胞出现凋亡、未见明显钙结节;诱导后 21 d 镜下观察见细胞中出现透明块状结节,呈成骨细胞形态特点。 结论 pH 为 8.5 时合成的 LNPs 具有低细胞毒性、高转染效率,能高效介导 BMP-2 基因转染大鼠 BMSCs,并成功诱导 BMSCs 成骨定向分化,其成骨诱导效果与成骨诱导液处理相当。LNPs 介导的基因转染可能是诱导干细胞定向分化的一种简便有效的手段。

    发表时间:2018-10-31 09:22 导出 下载 收藏 扫码
  • 负载BMP-2质粒的脂多糖胺纳米囊泡转染大鼠BMSCs的研究

    目的应用脂多糖胺纳米囊泡(lipopolysaccharide-amine nanopolymersomes,LNPs)作基因载体,评价其与目的基因复合及其在BMSCs中的转染情况,为LNPs介导的基因联合干细胞治疗骨缺损提供初步实验依据。 方法制备加载了BMP-2质粒(plasmid of BMP-2,pBMP-2)的LNPs(plasmid-loaded LNPs,pLNPs);通过凝胶阻滞实验探究pLNPs与pBMP-2结合能力随pLNPs中N元素和P元素比例(N/P)变化的关系;透射电镜及原子力显微镜下观察pLNPs(N/P=60)形貌;动态光散射仪检测其粒径及Zeta电位;探究pLNPs耐酶解能力随时间的变化规律;体外转染大鼠BMSCs,探究不同N/P条件下pLNPs转染后细胞存活率、转染效率,及最佳N/P条件下pLNPs转染BMSCs表达目标蛋白情况。 结果当N/P≥1.5时,pLNPs可完全阻滞pBMP-2;N/P为60时,pLNPs在原子力显微镜下呈大小均一囊泡状,透射电镜下pLNPs呈典型的类球形空心囊泡状,直径(72.07±11.03)nm;pLNPs粒径为(123±6)nm,Zeta电位为20 mV;pLNPs在4 h内耐DNaseⅠ酶解,6 h时对核酸保护能力稍下降。细胞存活率随N/P增加呈先增加后降低趋势,N/P为45时达最大值,N/P≤90时细胞毒性分级为1级,可用于体内实验;pLNPs转染效率随N/P增加而增大,N/P为60时达最大值;综合确定最佳N/P为60。在N/P为60转染BMSCs条件下,4 d内细胞持续高表达BMP-2。 结论LNPs能高效压缩pBMP-2形成复合物纳米囊泡,保护目的基因不被酶解,较聚乙烯亚胺25k和Lipofectamine 2000有更高的转染效率及蛋白表达量。

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