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  • 一种用于复合材料观察的快速病理制片方法研究

    目的探讨一种用于观察复合材料多孔结构及组分分布的简便、快捷病理制片方法。 方法以聚氨酯-小肠黏膜下层(polyurethane/small intestinal submucosa,PU/SIS)复合材料为例,经 OCT 包埋,行冰冻切片,大体观察切片完整性。切片经水溶性伊红的醇溶液染色,明场显微镜下观察复合材料上色效果及多孔结构。将染色切片分为 5 组,采用不同封片方式:A 组,甘油明胶湿封;B 组,无水乙醇脱水、TO 型生物透明剂透明、中性快干胶封片;C 组,去离子水浸泡分色、风干、中性快干胶封片;D 组,风干、TO 型生物透明剂透明、中性快干胶封片;E 组,风干、中性快干胶封片。于明场显微镜下观察复合材料形态与两种组分分布情况,选择最佳的制片方法。 结果大体观察制备的 PU/SIS 复合材料冰冻切片厚度均为 6 μm,切片完整连续。明场显微镜下观察示,切片伊红染色后可观察到材料清晰轮廓与多孔结构,但无法辨认两种组分。封片后,A、B、C 组材料组分仍不能辨认或溶解变形;D、E 组材料形状保持,两种组分清晰可见。 结论冰冻切片法制备 PU/SIS 复合材料标本,可通过伊红染色和中性快干胶封片的方法进行材料形态学和组分分布的表征。

    发表时间:2019-01-03 04:07 导出 下载 收藏 扫码
  • 脱细胞小牛肌腱组织形态学和生物力学特性研究

    目的研究反复冻融结合核酸酶处理小牛肌腱脱细胞效果以及对肌腱组织形态、结构、生化成分和力学特性的影响。 方法取新鲜1日龄西门塔尔小牛跟腱48根,随机分为3组(n=16):A组为正常对照组,B组采用液氮冷冻/37℃复温反复冻融5次,C组在反复冻融基础上结合核酸酶处理24 h。每组取2根跟腱用于扫描电镜观察,3根用于、组织学及免疫组织化学染色观察,3根用于DNA残留量检测,8根用于生物力学检测。 结果扫描电镜观察示A、B组胶原纤维排列致密有序,形态完整,未见断裂;C组胶原纤维排列松散,几乎无断裂。阿利新蓝、天狼星红染色及免疫组织化学染色示C组糖胺聚糖、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤维连接蛋白大部分被保留;HE染色和DAPI染色示A、B组胶原纤维间可见较多完整的细胞核,而C组胶原纤维之间未见完整细胞核,但腱内膜上仍有部分细胞核残留。A、B、C组的DNA残留量分别为(0.24 ± 0.12)、(0.16 ± 0.07)、(0.05 ± 0.02)μg/mg,C组显著低于A、B组(P lt; 0.05);A、B组间差异无统计学意义(P gt; 0.05)。 生物力学检测显示,A、B、C组间拉伸强度、断裂应变、刚度和弹性模量差异均无统计学意义(P gt; 0.05)。 结论反复冻融结合核酸酶处理小牛肌腱,可有效去除细胞成分,同时基本保留肌腱原始胶原纤维结构、形态、大部分细胞外基质成分和力学特性。

    发表时间:2016-08-31 04:07 导出 下载 收藏 扫码
  • 脱钙皮质骨基质的拉伸力学性能研究

    目的 探讨脱钙皮质骨基质厚度与拉伸力学性能的关系,为将其作为组织工程支架材料奠定实验基础。 方法 取市售新鲜小牛胫骨,常规快速脱钙制备脱钙皮质骨基质,大体观察其颜色、质地等物理性状,并进行脱钙检测。将脱钙皮质骨基质沿径向纵切成不同厚度的片材,并根据厚度分为4 组(n=16),分别为A 组100 ~ 300 μm,B 组300 ~ 500 μm,C 组500 ~ 700 μm,D 组700 ~ 1 000 μm;对每组标本进行拉伸性能和组织学观测。 结果 大体观察显示脱钙皮质骨基质经H2O2 处理后呈乳白色,柔韧性好,富有弹性。脱钙皮质骨基质的脱钙率达97.6%。A 组强度及弹性模量明显小于B、C、D 组(P lt; 0.05),B、C、D 组间比较差异均无统计学意义(P gt; 0.05);脱钙皮质骨基质刚度随厚度增加呈逐渐增大趋势,A 组刚度显著低于B、C、D 组(P lt; 0.05),B、C 组低于D 组(P lt; 0.05),B、C 组间差异无统计学意义(P gt; 0.05);各组极限应变差异均无统计学意义(P gt; 0.05)。组织学观察各组均可见典型骨单位结构,其最大直径范围为102 ~ 325 μm,平均最大直径为182 μm。 结论 骨单位的完整性对脱钙皮质骨基质的力学性能有重要影响;脱钙皮质骨基质作为组织工程支架材料,在厚度gt; 300 μm 时可保持其拉伸力学性能。

    发表时间:2016-08-31 04:23 导出 下载 收藏 扫码
  • 一种用于肌腱胶原纤维束及周围腱内膜组分分布形态学观察的快速组织学制片方法研究

    目的 探讨一种用于观察肌腱胶原纤维束及周围腱内膜形态与组分分布的快速组织学制片方法。方法 以猪趾浅屈肌腱组织为例,行冰冻切片,片厚 6 μm。大体观察切片完整性,HE 染色观察组织完整性与冰晶形成情况。然后,将切片分为 5 组,A 组行过碘酸雪夫(Priodic acid-Shiff,PAS)染色,B 组行 Masson 染色,C 组行网状纤维染色,D 组行Ⅲ型胶原免疫组织化学和免疫荧光染色,E 组切片经 65℃ 烘烤 10 min 后行 Masson 染色。观察各组肌腱胶原纤维束与周围腱内膜组分分布情况。结果 大体观察切片连续均匀;HE 染色见组织整体结构完整清晰,无冰晶空隙形成,但无法观察到胶原纤维束与周围腱内膜组分分布情况。A、B、C 组肌腱组织整体单一染色,无法辨认胶原纤维束与周围腱内膜组分分布;D 组周围腱内膜单独弱显色,两组分能差异化染色,但对比度不明显;E 组胶原纤维束与周围腱内膜差异化染色,两组分清晰可见。结论 猪趾浅屈肌腱冰冻切片后,通过 65℃ 烘烤 10 min 联合 Masson 染色方法可以快速准确显示胶原纤维束与周围腱内膜组分分布形态学表征。

    发表时间:2019-08-23 01:54 导出 下载 收藏 扫码
  • 人胎盘蜕膜基层来源MSCs参与裸鼠皮肤创面修复的研究

    目的探讨人胎盘蜕膜基层来源MSCs(placental decidua basalis derived MSCs,PDB-MSCs)参与裸鼠全层皮肤缺损修复的效果。 方法取自愿捐赠人胎盘组织,采用酶消化法结合密度梯度离心法分离培养PDBMSCs并传代,取第4代细胞进行实验。倒置相差显微镜观察细胞形态,行成骨与成脂诱导鉴定,检测细胞表面特异性抗原表达以鉴定细胞。取42只4~5周龄雌性BALB/c裸鼠,随机分为两组(n=21);分别将200 μL浓度为5×106个/mL的第4代PDB-MSCs及等体积PBS经尾静脉注射入实验组及对照组裸鼠体内;注射后3 d实验动物于背部制备大小为1.5 cm×1.5 cm全层皮肤缺损模型。术后1、2、4、7、14、18、21、25、30 d大体观察创面愈合情况,待创面开始脱痂后测量创面愈合率。术后1、7、14、21、30 d取材行HE染色,观察创面修复情况;7、14、30 d实验组采用免疫荧光染色法行细胞定位分析。 结果经鉴定胎盘蜕膜组织所分离的细胞为MSCs,具有多向分化能力和MSCs免疫组织表型。术后两组裸鼠存活至实验完成。大体观察示,实验组创面愈合较对照组快,其中实验组于术后12~14 d、对照组于14~17 d开始脱痂。实验组术后14、18、21 d创面愈合率均显著高于对照组(t=4.001,P=0.016;t=3.380,P=0.028;t=3.888,P=0.018);25、30 d两组比较差异无统计学意义(t=1.565,P=0.193;t=1.000,P=0.423)。组织学观察示,与对照组比较,实验组皮肤创面组织炎性反应低,并且随时间延长皮肤各层组织及腺体等再生良好。免疫荧光染色示,术后各时间点实验组皮肤创面区域均可见人线粒体抗原染色阳性,提示存在人源细胞。 结论通过酶消化法结合密度梯度离心法可稳定获得PDB-MSCs,预先注射入裸鼠体内后,在皮肤损伤条件下细胞可向皮肤损伤部位迁移,并促进创面修复。

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  • 一种优化的猪骨骼肌来源无细胞基质支架材料制备方法及鉴定

    目的探讨一种优化的猪骨骼肌脱细胞制备方法,以期制备理想的猪骨骼肌来源无细胞基质(decellularized porcine muscle tissue,DPMT)支架材料。 方法取市售新鲜健康成年家猪腰部骨骼肌组织,采用匀浆-球磨-去垢剂多步骤脱细胞方案制备DPMT。行组织学观察脱细胞、脱脂效果,天狼猩红染色分析胶原成分,扫描电镜观察材料内部微结构;测定材料中DNA含量及总蛋白质含量。取人脂肪来源干细胞(adipose derived stem cells,ADSCs)、小鼠成纤维细胞(NIH3T3)和人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),置于不同浓度DPMT浸提液中,培养后第1、3、5天采用细胞计数试剂盒8法测算细胞相对增殖率,评价材料细胞毒性;通过DPMT表面接种HUVECs体外共培养3 d后,行活死细胞染色评价其体外细胞相容性。采用SPF级雄性SD大鼠建立DPMT大鼠背部皮下植入模型,于植入3、7、14、28 d取材,大体观察材料降解情况,并测量其横径;行HE染色和CD31免疫组织化学染色观察其生物相容性和血管新生情况。 结果匀浆-球磨-去垢剂多步骤脱细胞方法操作简便,制备DPMT仅需1 d时间;检测显示DPMT脱细胞、脱脂完全,主要成分为Ⅰ型胶原及Ⅳ型胶原;DPMT中DNA含量为(15.902±1.392) ng/mg干重,总蛋白质含量占其干重的68.94%,显著低于新鲜猪骨骼肌组织[分别为(140.724±10.422) ng/mg干重及93.14%](P<0.05);DPMT内部呈均质疏松网状结构。体外细胞相容性实验显示DPMT细胞毒性评级均为0~1级,HUVECs在DPMT表面能稳定生长。DPMT大鼠皮下植入后14 d内可保持大体结构的稳定性,至28 d时完全降解;炎性反应在3 d时最明显,7 d时明显减轻,两时间点炎性细胞数量比较差异有统计学意义(P<0.05);植入后7 d即可见DPMT内部新生血管环结构形成,14 d时新生血管环数量显著增加,比较差异有统计学意义(P<0.05)。 结论匀浆-球磨-去垢剂多步骤脱细胞方案省时高效、可重复性佳,所制备的DPMT脱细胞、脱脂完全,蛋白质成分保存良好,具有良好的体内外生物相容性,且可能具有一定诱导血管新生潜能。

    发表时间:2016-10-21 06:36 导出 下载 收藏 扫码
  • 脂肪干细胞及血管内皮细胞提高游离脂肪移植成活的实验研究

    目的 探讨脂肪来源干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)及血管内皮细胞(endothelial cells,ECs)对脂肪移植术后血管新生及脂肪成活的影响。 方法 取乳房切除术患者自愿捐赠的脂肪组织,采用胶原酶消化法分离培养 ADSCs,取第 3 代细胞进行实验;同时制备游离脂肪颗粒。取健康 4~6 周龄雄性裸鼠 80 只,随机分为 4 组(n=20),分别于裸鼠背部皮下注射 1 mL 脂肪颗粒+0.3 mL 生理盐水(对照组)、1 mL 脂肪颗粒+2×106 个人脐静脉内皮细胞株(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)+0.3 mL 生理盐水(ECs 组)、1 mL 脂肪颗粒+2×106 个 ADSCs+0.3 mL 生理盐水(ADSCs 组)、1 mL 脂肪颗粒+1×106 个 HUVECs+1×106 个 ADSCs+0.3 mL 生理盐水(ADSCs+ECs 组)。注射后观察各组裸鼠存活情况,大体观察背部移植区色泽、形状。2、4、8、12 周时背部移植区行超声影像学观察,取标本采用排水法测量其体积,组织学观察移植脂肪大体结构变化情况,免疫荧光染色观察血管新生情况。 结果 各组裸鼠均存活至实验完成。移植后各时间点各组超声检测结果无明显差异,移植脂肪内部均未见明显血流信号,未见囊肿、钙化、实性占位等异常表现。移植后各时间点,ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组移植脂肪体积均高于 ECs 组及对照组(P<0.05);且 8、12 周时 ADSCs 组明显高于 ADSCs+ECs 组(P<0.05)。HE 染色示移植后各组组织学形态变化趋势相似,但 ADSCs 组组织重塑速度快于其他各组。免疫荧光染色示随时间延长各组新生血管逐渐增加,各时间点 ECs 组、ADSCs 组、ADSCs+ECs 组微血管密度均高于对照组(P<0.05);4 周时 ADSCs 组微血管密度高于 ECs 组及 ADSCs+ECs 组(P<0.05);8、12 周时 ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组高于 ECs 组(P<0.05),ADSCs 组及 ADSCs+ECs 组间比较差异无统计学意义(P>0.05)。 结论 ADSCs 可提高移植脂肪存活率,且该促进作用可能与促进血管新生相关。

    发表时间:2018-07-30 05:33 导出 下载 收藏 扫码
  • 简易大鼠挤压伤-挤压综合征模型建立的实验研究

    目的 建立一种简单有效、便于重复操作的大鼠挤压伤-挤压综合征(crush syndrome,CS)实验模型,为进一步研究CS奠定基础。 方法 2月龄健康雌性SD大鼠42只,体重160~180 g,随机分为实验组(n=36)和对照组(n=6)。实验组采用自制挤压伤模具挤压大鼠双下肢,制备挤压伤-CS模型;挤压后观察大鼠存活情况,分别于挤压2、4、8、12、24、48 h观察大鼠下肢改变及血尿情况,心脏采血行血生化检测;取挤压部位肌肉、肾脏、心脏行组织学观察。对照组不作处理,同上法采血及取相同部位组织进行检测比较。 结果 挤压期间实验组共7只大鼠死亡,15只出现血尿。挤压后存活大鼠双下肢肿胀,肌肉组织水肿。肝功能检测示,实验组各时间点谷丙转氨酶与谷草转氨酶均显著高于对照组(P lt; 0.05)。肾功能检测示,实验组挤压2 h后血尿素氮均显著增高,其中12、24、48 h与对照组比较差异有统计学意义(P lt; 0.05);实验组挤压4、8、12、24 h肌酐高于对照组,其中8、12、24 h与对照组比较差异有统计学意义(P lt; 0.05),实验组各时间点血清钾均高于对照组,除挤压2 h外其余各时间点与对照组比较差异均有统计学意义(P lt; 0.05)。心肌损伤检测示,实验组挤压后肌酸激酶呈上升趋势,其中4、8、12、24 h与对照组比较差异有统计学意义(P lt; 0.05)。组织学观察示,与对照组相比,实验组各时间点肌肉有明显水肿、坏死表现;肾脏出现肾小球充血肿胀,肾小管上皮细胞变性、水肿、坏死、肌红蛋白管型等;心肌结构无明显变化。 结论 采用自制挤压伤模具制备SD大鼠挤压伤-CS模型,操作简便,各项检测结果稳定,符合挤压伤标准,是建立挤压伤-CS动物实验模型的一种有效方法。

    发表时间:2016-08-31 04:05 导出 下载 收藏 扫码
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