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  • 全反式维甲酸与 VEGF 联合应用诱导小鼠胚胎成纤维细胞定向成骨分化

    目的研究全反式维甲酸(all-trans retinoic acid,ATRA)与 VEGF 联合应用对于小鼠胚胎成纤维细胞(mouse embryonic fibroblasts,MEFs)定向成骨分化的影响。方法取 NIH 孕鼠(孕 12~15 d)子宫内的胎鼠,去掉头、心、肝等器官后,采用胰蛋白酶消化贴壁法分离培养 MEFs。利用 HEK-293 细胞采用反复冻融法扩增重组腺病毒红色荧光蛋白(recombinant adenovirus-red fluorescent protein,Ad-RFP)及 Ad-VEGF。采用 ALP 染色和 ALP 定量检测法检测单独 ATRA 或 VEGF 以及 ATRA 和 VEGF 联合应用培养 MEFs 第 3、5 天 ALP 活性变化。将第 3~4 代 MEFs 分为 A、B、C、D 4 组,分别加入 DMSO+Ad-RFP、ATRA、Ad-VEGF、ATRA+Ad-VEGF。实时荧光定量 PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,qRT-PCR)检测第 3、7 天成骨相关标志物 ALP、Ⅰ 型胶原、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)及成血管相关标志物 VEGF、血管生成素 1(angiopoietin 1,ANGPT1)、内皮黏蛋白(endomucin,EMCN) mRNA 表达;免疫组织化学染色检测各组第 3、5、7 天 OPN、VEGF 蛋白表达;茜素红染色检测各组成骨诱导 14、21 d 钙盐沉积水平。取 15 只 4~6 周龄无胸腺雌性裸鼠,随机分为 3 组,每组 5 只,分别于背侧与腹侧皮下注射经 ATRA、Ad-VEGF、ATRA+Ad-VEGF 处理后的 MEFs。植入后 5 周行 X 线片观察、大体观察及组织学染色(Masson、HE 及番红 O-固绿染色),观察各组裸鼠体内异位成骨情况。结果成功分离培养 MEFs;扩增后的 Ad-RFP 及 Ad-VEGF 成功转染 MEFs,转染效率约为 50% 和 20%。ALP 活性检测示,单独使用 ATRA 或 VEGF 均能增强 MEFs 中 ALP 活性,且 ATRA 作用较 VEGF 强;ATRA 和 VEGF 联合使用较单独使用显著增强了 MEFs 中 ALP 活性(P<0.05)。qRT-PCR 检测示,ATRA 联合 Ad-VEGF 使用上调了早期成骨分化相关标志物 ALP、OPN、Ⅰ 型胶原 mRNA 相对表达量(P<0.05);7 d 时成血管相关标志物 VEGF、EMCN 及 ANGPT1 mRNA 相对表达量有所上升(P<0.05)。免疫组织化学染色示,ATRA 联合 Ad-VEGF 不仅增强了 OPN 蛋白表达,VEGF 蛋白表达在第 7 天也有所增强。茜素红染色示,单独应用 ATRA 或 Ad-VEGF 诱导钙盐沉积作用较弱,二者联合应用明显增强了 MEFs 成骨晚期钙盐沉积的效应。裸鼠体内植入实验结果显示,X 线片观察发现与其余两组相比,ATRA+Ad-VEGF 组存在明显骨块,且骨块体积较大,组织学染色可见大量胶原及成熟骨小梁、骨基质形成以及胶原骨组织。结论ATRA 与 VEGF 联合应用能诱导 MEFs 定向成骨分化。

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