蛋白质因子在调控骨改建过程中的作用机制研究进展_中国修复重建外科杂志

doi:10.7507/1002-1892.201808059

蛋白质因子在调控骨改建过程中的作用机制研究进展

李菊 ^1,2 , 郭晓东 ^1,2 , 李明政 ^1,2,3 , 肖宇 ^{1,2

,} , 包崇云 ^{1,3

,}

1. 四川大学口腔疾病研究国家重点实验室（成都 610041） ;
2. 国家口腔疾病临床医学研究中心（成都 610041） ;
3. 四川大学华西口腔医院口腔颌面外科（成都 610041）

收稿日期: 2018-08-11; 修回日期:2018-12-03;

基金项目: “十三五”国家重点研发计划（2016YEC1102702）；国家自然科学基金资助项目（81701027）；华西口腔医院青年研究基金（WCHS-201612）

通讯作者: 肖宇, Email: xiaoyu_8528@163.com 包崇云, Email: cybao9933@sina.com

Research progress on the mechanism of protein factors in regulating bone remodeling

LI Ju ^1,2 , GUO Xiaodong ^1,2 , LI Mingzheng ^1,2,3 , XIAO Yu ^{1,2

,} , BAO Chongyun ^{1,3

,}

1. State Key Laboratory of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China ;
2. National Clinical Research Center of Oral Diseases, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China ;
3. Department of Oral and Maxillofacial Surgery, West China Hospital of Stomatology, Sichuan University, Chengdu Sichuan, 610041, P.R.China

Corresponding Author: XIAO Yu, Email: xiaoyu_8528@163.com BAO Chongyun, Email: cybao9933@sina.com

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目的综述蛋白质因子在骨改建过程中的作用及机制，为进一步阐明骨相关疾病的发病机制及临床治疗提供理论依据。方法广泛查阅国内外近年相关研究成果，并加以分析、归纳和总结。结果骨改建是维持骨稳态的重要生理过程，蛋白作为骨改建过程中的重要刺激因子，调控着骨吸收与骨形成之间的平衡。结论目前对于蛋白在骨改建过程中的作用机制研究还不够充分，因此需要进一步深入研究相关蛋白在骨改建过程中的具体作用时间、作用过程以及蛋白互作网络，并确证其在骨改建中的作用机制，为骨相关疾病发病机制的揭示及治疗奠定基础。

Objective To review the role and mechanism of protein factors in bone remodeling, and provides theoretical basis for further elucidating the pathogenesis and clinical treatment of bone-related diseases. Methods The relevant research results at home and abroad in recent years were extensively consulted, analyzed, and summarized. Results Bone remodeling is an important physiological process to maintain bone homeostasis. Protein, as an important stimulator in bone remodeling, regulates the balance between bone resorption and bone formation. Conclusion At present, the research on the mechanism of protein in bone remodeling is insufficient. Therefore, it is necessary to further study the specific time, process, and protein interaction network of protein in bone remodeling, and to confirm its mechanism in bone remodeling, so as to reveal and treat the pathogenesis of bone-related diseases.

关键词: 骨改建; 蛋白质; 成骨细胞; 破骨细胞

Key words: Bone remodeling; proteins; osteoblast; osteoclast

骨是一种动态组织，随着承载机械负荷的变化，其血钙水平以及各种旁分泌、内分泌因素也会随之发生变化，进而导致骨的不断吸收和形成。两者的平衡是维持骨正常发育的关键。骨改建是一个动态的循环过程，主要是由破骨细胞主导的骨吸收和成骨细胞主导的骨形成两个方面共同组成^[1]。具体来说，在接到骨刺激信号（机械负荷、激素、生长因子）后，破骨细胞先出现在骨表面，通过细胞外酸性基质吸收矿物成分，形成骨吸收陷窝；成骨细胞一旦被破骨细胞接触，或者被破骨细胞可溶性因子刺激，将立刻在陷窝部位沉积骨样物质，引发后续的骨形成阶段。研究表明，骨改建是一个周期长且比较复杂的生理过程，受到多种因素的影响。其中，蛋白质因子作为一种主要的骨刺激因子，其特殊的结构和功能将决定上述细胞的增殖及活性，同时介导细胞之间的相互作用，最终影响骨改建过程的稳定状态^[2]。比如破骨细胞质膜上的组织蛋白酶 K（cathepsin K，CTSK）可有效降解骨有机质，对骨吸收过程有明显的加速作用；而成骨细胞中的 BMPs 则是唯一能单独诱导骨组织形成的局部生长因子，能够有效提高骨形成及发育的效果。因此，蛋白质因子在调控骨改建过程中发挥着关键作用，深入研究其具体影响和相关机制将对于探索骨相关疾病的病理以及寻找合适的治疗手段具有重要意义。本文将对骨改建过程中涉及到的主要蛋白质因子及其机制综述如下。

1 蛋白质因子在骨吸收过程中的作用机制

骨吸收是由破骨细胞通过分泌酸性物质及蛋白酶来降解骨组织中的骨盐和骨基质成分的过程，包括破骨细胞的附着和极化、基质脱矿和降解、细胞脱落等行为^[3]。骨吸收过程中涉及到众多蛋白因子，其中 CTSK、抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRACP）和基质金属蛋白酶 9（matrix metalloproteinase 9，MMP-9）是破骨细胞的标志酶；骨保护素（osteoprotegerin，OPG）/NF-κB 受体活化因子配体（receptor activator of nuclear factor-κB ligand，RANKL）/NF-κB 受体活化因子（receptor activator of nuclear factor-κB，RANK）是骨吸收的主要信号因子；此外，鸟苷三磷酸酶结合蛋白家族（Rho GTPases）影响着破骨细胞封闭区功能；白介素类蛋白（interleukines，ILs）既能刺激破骨细胞的形成与增殖，又能抑制其分化。

1.1 破骨细胞标志酶

1.1.1 CTSK

CTSK 是一种破骨细胞分泌的半胱氨酸蛋白酶，主要存在于破骨细胞溶酶体和细胞质囊泡中^[4]。它是破骨细胞唯一高表达的组织蛋白酶，且 CTSK 过表达可明显加速骨吸收进程，因此常作为破骨细胞的标志物使用^[5]。

因其分子结构中具有疏水性侧链，易于降解胶原螺旋结构域，所以 CTSK 在骨吸收过程中可以完全降解胶原蛋白和其他基质蛋白。相关研究显示，CTSK 能在 24 h 溶解孵育的成年皮质骨胶原螺旋和端肽的 40%，72 h 溶解 80%，96 h 接近 100%^[6]。其机制主要是依靠 CTSK 的聚脯氨酸区可以对Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原进行剪切，进而有效地将胶原三螺旋和肽的胶原蛋白分离出来，最终产生胶原单体。2012 年 Borel 等^[7]将提取得到的骨胶原与不同浓度下的人重组 CTSK 及其抑制剂进行孵育培养，结果显示 CTSK 能够优先溶解成熟的胶原基质。

在骨代谢疾病研究方面，CTSK 基因敲除小鼠表现出骨质疏松症状，且这种症状是基质降解而非脱矿导致的，此结论完全符合 CTSK 的基质降解功能^[8]。缺乏 CTSK 将导致小鼠骨吸收能力受损，并且进一步引发骨硬化疾病^[9]。由此可见，CTSK 与某些骨代谢疾病的发生与发展密切相关。

目前，随着对 CTSK 的结构、作用以及致病机制有了更为清晰的理解，许多研究开始致力于开发 CTSK 的有效抑制剂来治疗某些相关骨代谢疾病。与其他抗吸收剂相比，CTSK 抑制剂对降低骨吸收生化指标同样有效，但同时会减少骨形成标志物的活性，具有一定的致病风险。如奥当卡替可有效降低多个部位的骨折几率，但同时它也可能引起脑血管的意外疾病。因此，只有通过对 CTSK 抑制剂生物学特性及临床效果进行不断优化，彻底排除对其他疾病的致病风险后，才有望成为一种治疗骨质疏松症的新方法^[10]。

1.1.2 TRACP 5b

TRACP 是酸性磷酸酶的第 5 型同工酶，为一种高度保守的金属蛋白酶，根据其糖基化形式的不同可分为 5a 和 5b 两种类型。其中 TRACP 5b 的活性与骨代谢标志物的表达变化显著相关，同时与骨矿物质密度成负相关，其功能与 CTSK 类似，也具有降解骨有机质的作用。TRACP 5b 产生于 CTSK 降解有机质的过程中，当最初的降解产物连同 CTSK 被吞噬进入破骨细胞并通过细胞膜转囊泡进行运输后^[11-12]，含有 TRACP 的囊泡被融合到这些囊泡中，进而产生具有高度特异性的 TRACP 5b^[13-14]。当囊泡移开吸收旋涡时，其 pH 值变为中性，为 TRACP 的活性氧（reactive oxygen species，ROS）发挥功能提供最佳环境，然后 ROS 在其胞吞作用下会进一步促进有机基质的降解^[15]。

由于 TRACP 5b 与破骨细胞的数量以及反映破骨活性的胶原蛋白密切相关，因此多数研究把它作为破骨细胞数量的准确标志物，可用于测定动物模型中破骨细胞的数量，或者用于体外骨细胞培养中对破骨细胞的微观计数等功能^[16]。1984 年 Alatalo 等^[16]【核！该文献是 2000 年的？】研究了小鼠体外破骨细胞分化过程中 TRACP 5b 的释放，发现 TRACP 5b 的活性与破骨细胞数量有显著相关性（P<0.000 1）；2008 年 Rissanen 等^[16]【核！全文未见该文献？】探讨了阻断雌激素对去势大鼠模型中破骨细胞数量和活性的影响，进一步证明 TRACP 5b 是检测破骨细胞数量的一个可靠指标。临床试验结果也同样证实 TRACP 5b 可以作为骨吸收速率的量化指标^[17]。此外，TRACP 5b 还受甲状旁腺激素和降钙素的调节，甲状旁腺激素刺激破骨细胞分泌 TRACP，而降钙素则能抑制其分泌。

1.1.3 MMP-9

MMP-9 又称明胶酶 B，是主要骨吸收蛋白酶之一，属于 MMPs 的成员。由于它是破骨细胞中含量最丰富的 MMP，且通过降解Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ型胶原，加速细胞外基质的降解，所以常作为破骨细胞的标志物使用。

MMP-9 作为骨吸收过程中的关键酶，通过影响破骨细胞的迁移、破骨细胞的招募和细胞外基质中生长因子的释放，调控骨吸收进程。在迁移和骨吸收过程中，破骨细胞会分泌 CD44 和 MMP-9 进入再吸收区，两者在细胞表面结合后产生的复合物，能直接加速Ⅳ型胶原蛋白的降解。因此，可通过加入 MMP-9 化学抑制剂弱化破骨细胞的迁移能力，减缓骨吸收进程^[18-19]。2007 年 Samanna 等^[20]利用双膦酸阿仑膦酸盐和细胞松弛素 D 抑制肌动蛋白的聚合，有效阻断细胞表面 CD44/MMP-9 复合物的形成，同时也抑制了 MMP-9 的激活，降低了破骨细胞的迁移效率，该结果提示 CD44/MMP-9 复合物的形成可能是破骨细胞功能中的一个独特的运动增强信号。另外，缺乏 MMP-9 的小鼠则出现破骨细胞招募延迟的现象^[21]。

1.2 骨吸收的主要信号因子

上世纪 90 年代发现，RANK 和 RANKL 是破骨细胞前体完全分化为成熟破骨细胞的必要因子，而 OPG 作为 RANKL 的受体调控破骨细胞发育，因此 OPG/RANKL/RANK 被视为影响骨吸收过程的主要信号因子。

1.2.1 RANKL/RANK

RANKL/RANK 信号调控着破骨前体细胞形成多核破骨细胞以及它们在正常骨骼改建和各种病理条件下的激活和存活。其中 RANK 属于 TNF 受体（TNF receptor，TNFR）超家族，是一种存在于成熟破骨细胞表面的Ⅰ型跨膜蛋白，具有一个大的 C-胞浆域和一个 N-胞外域，其多聚化结构中含有丰富的半胱氨酸。与其他 TNFR 相关蛋白一样，能激活细胞内信号传导级联反应。1999 年 Dougall 等^[22]发现 RANK 是破骨细胞和淋巴结发育的一个必要受体，能够为淋巴结组织和破骨细胞分化提供关键信号。2000 年 Li 等^[23]通过载体构建 RW4 胚胎干细胞 RANK 基因敲除（RANK^-/-），得到的基因敲除小鼠表现出破骨细胞增殖及骨吸收过程均被抑制的现象；而当把 RANK 的 cDNA 转染进入 RANK^-/-小鼠造血前体细胞，可启动破骨细胞生成。随后研究发现，RANK 是一种细胞表面决定因素，它可以影响 OPG 配体在骨吸收和骨改建中的作用，以及介导钙激素和促生长因子的生理和病理效应。

RANKL 是 RANK 的配体，它是与巨噬细胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）相关的Ⅱ型跨膜蛋白，隶属于 TNF 超家族，在成骨细胞表面表达，可被几个细胞外蛋白酶分解并从细胞膜中释放出来。有研究认为 RANKL 是作为一种膜相关因素而支持破骨形成；同时，RANKL 是破骨细胞前体细胞招募和成熟的关键调节因子，在一定程度上介导了几种重要骨吸收刺激剂的作用，这些刺激剂会聚集在成骨相关细胞表面以产生 RANKL，然后 RANKL 直接激活破骨细胞及其前体。RANKL 通过 TNFR6 衔接蛋白结合 RANK，激活破骨细胞前体细胞中 NF-κB 和 c-JNK 信号，从而刺激破骨细胞前体分化为成熟破骨细胞并促使其进一步活化^[23]【文献 24？请核实！】。另外，中和 RANKL 的抗体能抑制由前列腺素 E2、1，25-二羟基维生素 D3 和甲状旁腺素诱导的骨吸收。

1.2.2 OPG

OPG 是 TNF 受体家族成员之一，主要功能为负调节破骨细胞的形成及骨吸收过程。OPG 包含 3 个结构域，第一个是 N 末端丰富的半胱氨酸结构域，是破骨形成抑制及半胱氨酸 400 介导的 OPG 二聚体化所必需的；第二结构域是肝素结合域，能与许多软骨互动；第三个是对应于死亡域同源区，由 OPG 和 Fas 跨膜区组成的嵌合体蛋白，在细胞中的过度表达导致细胞凋亡。3 个结构域的数量和分布决定了 OPG 的生物活性。

OPG 作为一个可溶性受体，通过与 RANKL 结合来竞争性抑制 RANK 与 RANKL 的相互作用，从而抑制破骨细胞的分化和吸收，调节骨稳态。因此，OPG 和 RANKL 基因的平衡表达是调节骨密度的关键。Mizuno 等^[25]通过基因敲除 OPG（OPG^-/-）构建了第一个骨质疏松小鼠模型，研究结果证实 OPG 是抑制破骨细胞生成的一个关键因子。Bucay 等^[26]发现 OPG^-/-小鼠的骨质密度呈现明显下降，其特征表现为较大的小梁骨和皮质骨孔隙度，颅骨明显变薄，骨折发生率较高。此外，OPG 能够抑制 Rho GTPase 信号传导途径基因的表达，进一步导致破骨细胞密封区的破坏，抑制骨吸收^[27]。

1.3 其他影响骨吸收过程的蛋白因子

1.3.1 Rho GTPases

Rho GTPases 又称为小 G 蛋白家族，习惯性称为 Rho GTP 酶，是 Ras 超家族的一个亚家族，主要包括 Rho、Rac 和 Cdc42。Rho GTPases 可以影响破骨细胞的极性、迁移、囊泡和分裂等过程，同时可对破骨细胞的黏附、分化以及封闭区的形成产生影响，进而影响破骨细胞的功能^[28]。

破骨细胞的封闭区结构是一个富含伪足的宽厚环，由富含 F-actin 及 CD44 的内核以及相关黏附蛋白组成，该结构能够将破骨细胞牢固地与骨基质结合。研究表明，Rho GTPases 能够参与维持伪足的稳定，从而保证破骨细胞封闭区结构不受影响，通过添加抑制剂降低 Rho 活性后，破骨细胞的封闭区将受到明显破坏。

Rac1 是 Rho GTPases 的重要成员，在调控破骨细胞功能的过程中起着关键作用。研究表明 Rac1 基因敲除后小鼠骨密度、骨体积分数、骨小梁厚度均明显提高，而小梁间体积降低，但破骨细胞的数量未发生明显改变，说明 Rac1 主要是通过影响破骨细胞的功能来实现对骨量的调控。以 RNA 干扰下调 Rac1 后发现细胞的破骨分化受到影响，表现为封闭区完整性缺失以及细胞融合减少，说明 Rac1 能够促进破骨细胞封闭区的形成以及破骨细胞的分化。Rac1 主要位于破骨细胞 F-actin 以及相关黏附蛋白周围，局部注射 Rac1 有助于提高破骨细胞的迁移速率并促进封闭区的形成，而抑制 Rac1 则会导致 Vinculin 聚集失活并与 F-actin 解除联系，从而影响细胞黏附与功能，说明 Rac1 可能通过对细胞黏附斑以及细胞骨架形成与解聚的影响调控破骨细胞的功能。

1.3.2 ILs

ILs 是骨改建过程中的一类重要调控因子，共有 33 种。其中 IL-3、IL-4、IL-10、IL-13 抑制破骨细胞的分化，IL-1、IL-6、IL-11 刺激破骨细胞的形成和增殖。

IL-1 可激活破骨细胞并影响破骨细胞的形成与增殖，但单独的 IL-1 不能刺激破骨细胞前体细胞分化为破骨细胞，必须与 RANKL 协同作用才能诱导破骨细胞的形成。IL-1 通过增加 M-CSF 来促进骨吸收进程，而 M-CSF 与 M-CSF 受体结合将进一步激活 RANKL，促进破骨细胞前体分化为破骨细胞。

IL-6 主要来源于成骨细胞和基质细胞，其作用是促进破骨细胞增殖及提升骨吸收效率。IL-6 在骨改建中的具体作用是，首先刺激 RANKL 相关破骨细胞下游效应物——成骨细胞的产生；然后，所产生的效应物能以自分泌或旁分泌的方式直接激活破骨细胞活性。Palmqvist 等^[29]研究表明，单独的人源 IL-6 和可溶性 IL-6 受体均不能刺激骨吸收，但当两者结合时，能显著刺激骨外植体的矿化及基质释放。

IL-11 与 IL-6 拥有许多类似的生物学特性，两者通过一个共同的信号转导因子糖蛋白 130 发挥作用^[30]。IL-11 富含亮氨酸和脯氨酸，可通过抑制成骨细胞的活性进而抑制骨形成，同时还能刺激破骨细胞形成和增殖。

2 蛋白在骨形成过程中的作用机制

骨形成是一个成骨细胞铺设形成新骨基质的过程，其中 MSCs 分化成骨是该过程的重要步骤。MSCs 分化为成骨细胞进而形成新骨组织是一个有序的过程，通过细胞增殖、分化、细胞外基质形成和矿化阶段逐步进行。Kulterer 等^[31]利用寡核苷酸芯片基因表达分析，证明了 MSCs 体外分化的特定时间，0～4 d 为增殖期，4～14 d 为基质成熟期，14～21 d 为成矿期。进一步研究发现，4～14 d 为成骨分化早期，14～21 d 为成骨分化晚期^[32]。

在 MSCs 成骨分化过程中，蛋白因子骨碱性磷酸酶（bone alkaline phosphatase，BALP）、Ⅰ型胶原、骨钙蛋白（osteocalcin，OCN）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨涎蛋白（bone sialoprotein，BSP）等都参与了基质形成和矿化，其中 BALP、Ⅰ型胶原、BMP-2 是成骨分化早期标志物，OCN、OPN、BSP 则是晚期标志物 ^[33-35]。

2.1 成骨分化早期标志性蛋白质

2.1.1 BALP

BALP 是同型二聚体糖蛋白构成的一种胞外酶，合成于骨基质成熟阶段，与成骨细胞和前成骨细胞活性成线性相关，被认为是最精确的骨形成标志物。1977 年 Fleisher 等^[36]发现 ALP 活性在 11～14 岁青少年体内达到高峰，提示 ALP 可能促进早期骨骼的生长。1983 年 Canalis^[37]体外研究表明，胎鼠颅骨中 ALP 的活性与胶原蛋白的产生率成正比。同年 Marie 等^[38]的正常幼鼠体内研究显示，ALP 的活性与成骨细胞数量成正相关。随后研究发现，体外 BALP 的活性正调控骨骼胶原的形成^[39]。综上，可以将 BALP 作为骨骼组织中骨形成率的一个通用指标^[40-41]。

此外，BALP 还是基质钙化过程中的第一个参与因子，在骨基质成矿中主要通过调节无机磷酸盐（Pi）和无机焦磷酸盐（PPi）之间的平衡来刺激矿化。所以，常把 BALP 作为成骨分化早期的标志。一般认为 BALP 产生的 Pi 是形成羟基磷灰石（hydroxyapatite，HA）所需要的，但水解 PPi 达到一定的 Pi/PP 比例也能实现 HA 晶体形成和生长，其确切的释放机制仍不清楚^[42]。

2.1.2 Ⅰ型胶原

Ⅰ型胶原是骨细胞外基质的主要有机成分，是早期骨祖细胞的标志物^[43]。它由 3 条多肽链组成的右手螺旋分子组成，有 2 个相同的 α1 链和 1 个 α2 链，作为骨基质的主要结构蛋白，占骨胶原总量的 95%，骨组织总蛋白的 80%。甚至有研究认为正常骨基质仅含有Ⅰ型胶原^[44]。1999 年 Jikko 等^[45]发现Ⅰ型胶原的 mRNA 表达水平在骨形成早期上调，提示Ⅰ型胶原可能是成骨早期的标志物。2014 年 Twine 等^[46]鉴定了包括Ⅰ型胶原在内的骨骼相关基因在 8 个时间点的表达情况，证实了Ⅰ型胶原是成骨分化的早期标志物。此外，研究表明 ALP 的表达取决于Ⅰ型胶原的产生量^[47-48]。因此Ⅰ型胶原是成骨分化早期的另一标志物。

从作用机制上来说，Ⅰ型胶原通过增强成骨细胞蛋白激酶 C 的活性，刺激 MSCs 分化为成骨细胞；然后，成骨细胞从微环境中摄取所需的氨基酸，合成并分泌胶原纤维及有机质。此外，Ⅰ型胶原还可增加组织血管数量，减慢巨噬细胞及破骨细胞活性，达到减轻炎性反应的效果。由于其具有生物可降解性、生物相容性和低免疫原性，而被广泛用作组织工程支架材料中，也可以作为涂层或增强材料与其他骨组织工程直接材料复合使用。

2.1.3 BMP-2

BMPs 是 TGF-β 超家族（TGF-βs）中的一种低分子量酸性糖蛋白，富含谷氨酸，其分子结构是由 2 个多肽链通过 1 个单一的二硫键结合而成的二聚体分子，与 HA 具有较高的亲和性，是唯一能单独诱导骨组织形成的蛋白质因子。因此常与骨组织工程支架材料复合使用，以调节成骨细胞分化和骨形成过程。

迄今为止，已经鉴定出 20 多种 BMPs，但只有几种可以诱导新骨形成。目前发现 BMP-2、BMP-4、BMP-7、BMP-9 对成骨细胞分化和骨形成起着重要的促进作用，其中 BMP-2 是 BMPs 家族最有效的成骨促进因子，且主要影响 ALP 的活性，因此常作为早期成骨分化的标志物。

BMP-2 通过刺激 ALP 的活性，上调 Runx2、Ⅰ型胶原、OCN、BSP 等成骨特异性基因的表达，促进成骨分化进而增加骨形成。早期研究发现 BMP-2 通过 Smad 或 GR 依赖性信号传导途径，调控转录因子 Runx2 和锌指结构转录因子 osterix，同源框基因 Dlx5 和 Msx2 的表达来调节 ALP 的转录。2010 年 Mikami 等^[49]发现 BMP-2 和地塞米松在成骨分化的同一阶段相同路径促进 ALP 的表达，且这种协同作用是通过 JAK/STAT 信号通路完成的。另一方面，将 BMP-2 与 BMP 家族的其他蛋白联合应用，可在一定程度上提升骨形成效率。

2.2 成骨分化晚期标志性蛋白质

OCN 和 OPN 是主要的非胶原蛋白，它们在骨骼的生物和机械功能中起着关键作用。在矿化过程的后期，它们直接或间接地控制骨骼质量、矿物大小和方向^[50-52]。因此，这两种蛋白因子都可以作为晚期矿化的标志物。

2.2.1 OCN

OCN 是继胶原后的第二丰富蛋白，由于其在成骨晚期的表达随细胞分化和基质矿化而增加，且具有调控骨矿物沉积和转移的作用，因此作为矿化晚期的标志物使用。结构上，它是由 46～50 个氨基酸组成的相对分子质量为 6×10³ 的小蛋白质，含有 3 种维生素 K 依赖的 γ-羧基谷氨酸，其残基具有较高的 Ca²⁺ 结合亲和力，且能稳定 OCN 的 α-结构，使 OCN 能与 HA 结合在一起^[53]。

尽管 OCN 在骨骼发育过程中起着至关重要的作用，且是多个领域骨骼形成和改建的标志物，但其确切的生理意义还未研究清楚。目前研究认为，OCN 具有促进成骨细胞分化成熟、骨细胞形成，维持骨正常矿化的作用。在 Rammelt 等^[54]的研究中，OCN 能够加速新形成的编织骨与内在骨组织的融合，在 OCN 复合 HA/胶原植入物周围的界面处，骨特异性基质蛋白和多功能黏附蛋白表达增加，表明 OCN 可加速骨形成和再生。2017 年 Tsao 等^[55]通过小干扰 RNA 沉默 OCN 后，矿物质的成熟被推迟，实验组 HA 总量低于对照组，且 Runx2、ALP、Ⅰ型胶原等成骨相关基因的表达受抑制，从而证明了 OCN 对矿物质的成熟具有促进作用，并可调节 MSCs 的成骨分化。这与早期研究结果并不相符。1996 年 Ducy 等^[56]在 OCN^-/- 小鼠体内发现，长骨皮质厚度和密度随着矿化骨基质数量的增加而增加，卵巢切除术前后的组织形态学表明，OCN 的缺失会导致骨形成的增加。相似的是，Bodine 等^[57]在培养基中加入不同浓度的 OCN 培养成骨细胞，结果显示 ALP 的活性随 OCN 浓度的升高而降低，提示 OCN 抑制成骨细胞活性。这些研究表明，OCN 负调控骨形成过程。

2.2.2 OPN

OPN 也被称为分泌磷蛋白 1，由 260～317 种氨基酸组成，相对分子质量为 33×10³，是一种高度保守的多功能糖蛋白，主要沉积在细胞矿化组织表面的界膜处、骨质成矿位点及矿化前的有机物质中，通常被视为骨基质中细胞与 HA 的桥梁。研究发现，OPN 在骨改建中主要发挥 3 个方面的功能：调控骨细胞的黏附、调控基质矿化、调控破骨细胞的功能^[58-59]。

OPN 在成骨细胞中原位存在，在软骨内/膜内成骨过程中积聚在矿化骨基质中，通过增强成骨细胞的分化与增殖来增加 ALP 的活性。Kojima 等^[60]通过重组腺病毒载 OPN 的 cDNA 转染进入大鼠骨髓源成骨细胞的实验，表明 OPN 过表达不仅能显著提高 OCN 和 ALP 的表达，还能增强钙结节的形成及 ALP 的活性。OPN 作为信号分子直接参与生物矿化过程，可直接结合到特定的磷灰石晶体表面，作为矿化抑制因子发挥作用。

此外，OPN 还通过刺激破骨细胞表面 CD44 的表达，促进破骨细胞黏附、迁移及骨吸收，同时作为细胞因子与 α_Ⅴβ₃ 结合，激活非受体酪氨酸激酶和磷脂 3 羟基激酶，以刺激破骨细胞的信号传导。

2.2.3 BSP

BSP 是 MSCs 成骨分化的晚期标志物，占骨骼和牙基质中非胶原蛋白的 8%～12%，由 281～327 种氨基酸组成，相对分子质量为（60～80）×10³。Mizuno 等^[61]将骨髓细胞培养在含抗 BSP 单克隆抗体的胶原基质中，结果显示成骨表型的表达被抑制，但添加牛骨 BSP 后可消除抗体的效果，重新激发骨髓细胞成骨表型的表达。Gordon 等^[62]发现小发夹 RNA 编码质粒抑制 BSP 表达，同时也抑制成骨标志物的表达和钙结节的形成，而体外成骨细胞过表达 BSP 能有效提高成骨分化及基质矿化，体内小鼠基因敲除实验结果与体外一致^[63]。进一步研究表明，成骨细胞过表达 BSP 可增强矿化作用，当加入抗 BSP 抗体后，成骨细胞则不表达 OCN 和 OPN 等成骨相关基因^[64-65]。综上，BSP 可作为标志物检测晚期成骨分化。

同时，BSP 还是生物矿化和成骨分化的一个促进剂。这是因为 BSP 具有大量磷酸根和负电荷，可以与 Ca²⁺ 结合形成螯合物，参与胶原黏附、HA 成核和基质矿化等过程^[66]。BSP 参与 HA 成核是由 BSP 中央区域的聚谷氨酸序列决定的，N-末端胶原结合域使 BSP 结合胶原来促进 HA 成核，C 末端的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸基序通过结合整合素，促进成骨分化和基质矿化。BSP 不仅能促进成骨细胞的分化与矿化，而且还与破骨细胞分化和过度活跃的骨吸收密切相关。

2.3 整合素

整合素是由 α 和 β 亚基组成的异二聚体黏附分子，通过装配与细胞骨架相关的胞内蛋白质来控制黏着斑和细胞在细胞外基质上的附着。它是多种骨基质蛋白（Ⅰ型胶原、OPN、BMPs 等）的受体，包括胶原受体 α₁β₁/α₂β₁、层粘连蛋白受体 α₃β₁/α₇β₁、纤连蛋白受体 α_Ⅴβ₃/α₄β₁/α₅β₁、玻连蛋白受体 α_Ⅴβ₃/α_Ⅴβ₅ 等。因此整合素可以通过介导细胞-基质之间的相互作用，促进成骨细胞迁移、增殖、存活及分化^[67]。例如，α₂β₁ 是Ⅰ型胶原的主要受体，调控着小鼠成骨细胞中胶原的合成；α₄β₁ 通过促进成骨分化和骨形成，进而有效改善骨质疏松小鼠的骨密度；α₅β₁ 具有增加小鼠骨形成及改善骨骼修复的作用等。此外，某些整合素也参与了细胞迁移以及破骨细胞黏附等生理过程。

3 基于蛋白质组学技术的其他成骨相关蛋白的发现

在骨改建过程中具有关键调控作用的蛋白质因子种类繁多，利用传统的研究方法难以快速、全面地发现、鉴定并表征关键差异蛋白的结构、功能以及相关机制。随着蛋白质组学技术的发展，上述问题有望得到解决。蛋白质组学是以蛋白质组为研究对象，利用一定技术手段在整体水平上揭示细胞内蛋白质的组成、结构、活动规律及其生物功能的科学，包括蛋白质的定性鉴定、定量分析、蛋白质加工修饰。根据蛋白质组学的研究策略，将蛋白质组学分为表达蛋白质组学、比较蛋白质组学和临床蛋白质组学。其中比较蛋白质组学着重于研究不同时期细胞蛋白质的表达变化，或蛋白在不同环境下的差异表达，故其在各类疾病机制的揭示、药物作用靶点的确定以及分子诊断等诸多方面发挥着重要作用。临床蛋白质组学通过检测不同病理过程中蛋白质种类和数量的变化，进而筛选到与疾病相关的生物标志物，为疾病病因和发病机制的揭示提供客观依据。综上，蛋白质组学方法是阐明蛋白质因子在骨改建中的功能及相关调控机制，以及检测骨相关疾病生物标志物的有效手段。下面将对近年来利用蛋白质组学技术发现的几类参与骨改建过程的差异蛋白进行介绍。

MSCs 成骨分化是一个复杂过程，涉及到成百上千的蛋白质，其中几种具有明显表达差异的蛋白，可能是成骨分化过程中的特异性标志因子。脂肪来源人 MSCs 中的Ⅰ型胶原、OCN、BMP-6、LIM 矿化蛋白 1（LIM mineralization protein-1，LAMP-1）直接与成骨途径相关，由于前 3 种蛋白可用于检测成骨分化过程，因此可以认为 LAMP-1 可能也是一个特异性标志蛋白^[68]。另外，Granéli 等^[69]在人 BMSCs 成骨成脂分化蛋白质谱中，发现 3 个特异性候选标志物——CD10、CD29、CRYaB（晶体蛋白 αB），其中 CRYaB 只在人 BMSCs 成骨分化中显著增加，而对人 BMSCs 成脂、成软骨分化无影响。

研究还发现，膜联蛋白是 MSCs 成骨分化过程中的一类关键蛋白。2007 年 Zhang 等^[70]对人 BMSCs 成骨分化过程中蛋白质的表达进行分析，揭示了 102 个蛋白位点的表达具有≥2 倍的差异，并成功鉴定出 52 个差异表达蛋白，其中膜联蛋白 A1（annexin A1，ANXA1）的表达在第 3 天及第 7 天均下调。William 等^[71]和 Ye 等^[72]认为 ANXA1 参与调控了 BMSCs 的生长、分化和凋亡；另外 ANXA2 及 ANXAⅤ的表达量在第 3 天及第 7 天均增加，说明了 ANXA1、ANXA2 和 ANXAⅤ在 MSCs 成骨分化中可能存在不同的调控作用。周颖等^[73]对 BMSCs 定向成骨诱导 0、1、7、14、21 d 的蛋白谱进行分析，结果显示 ANXA2 的表达为不同程度的上调趋势，进一步证实了其在成骨过程中具有促进作用。Kim 等^[74]对人 BMSCs 成骨分化中分泌蛋白质的研究显示，在成骨过程中，钙稳态相关蛋白质的表达上调，包括 ANXA1 和 ANXA2，而 ANXA1 的表达与 Zhang 等^[70]的结果相矛盾。在近年的研究中，Alves 等^[75]证明了纤连蛋白 1、ANXA2 和核纤层蛋白 A/C 特异性调节成骨分化的不同阶段，但其具体的作用机制并不清楚。随后，Pan^[76]等发现，沉默 ANXA1 可显著抑制细胞外信号调节激酶 1/2 的磷酸化以及成骨相关基因（Runx2、OPN、OCN）的表达，并导致大鼠 BMSCs 成骨分化减少，确证了 ANXA1 可促进 BMSCs 的增殖和成骨分化。

虽然蛋白质组学技术能快速、全面地检测成骨分化过程中的差异表达蛋白，但鉴定得到的成骨分化相关蛋白不一定是特异性表达蛋白，需通过蛋白质功能研究方法来进一步阐述。如 Kim 等^[77]首次鉴定出 4 种与 MSCs 成骨分化相关的蛋白质——磷酸甘油变位酶 1、前折叠素 3、热休克蛋白 27 kDa、β-肌动蛋白，但由于这些蛋白也可用作成骨细胞溶质生物标志物，因此均不能认为是成骨细胞特异性蛋白。

此外，不同 MSCs 分泌的细胞外基质在调节 MSCs 的成骨能力方面起着关键作用，细胞外基质蛋白的作用更多地指向调节细胞功能和骨形成相关的过程，如血管生成，而不是直接影响矿化^[78]。

4 小结与展望

体内骨稳态是一个新骨与旧骨不断更替的动态平衡过程，骨稳态平衡一旦失调，就会导致严重的骨代谢疾病，如骨质疏松、骨硬化病、风湿性关节炎等。骨改建是维持骨稳态的重要生物学过程，蛋白作为骨改建过程中的重要骨刺激因子, 调控着骨吸收与骨形成之间的平衡。

目前，骨代谢疾病的研究主要集中于发病机制及药物治疗方面，由于蛋白质是生理功能的执行者、生命现象的直接体现者，因此对蛋白质结构和功能的研究，将直接阐明机体在生理和病理条件下的变化机制，而理解骨改建过程中关键蛋白的分子结构及作用机制，是解决以上问题的基础。

本文详细综述了破骨细胞主导的骨吸收过程中破骨细胞标志酶、骨吸收的主要信号因子、Rho GTPases 和 ILs 等蛋白因子的结构特点、作用机制及研究进展，同时也说明了成骨分化早期、晚期标志性蛋白及整合素在骨形成过程中的作用机制，但某些蛋白的生理意义尚存在争议，还有待进一步研究确证。此外，还阐述了蛋白质组学技术在 MSCs 成骨分化中的研究应用，结合其他分子技术研究发现，LAMP-1、CRYaB、ANXA1、ANXA2、ANXAⅤ等蛋白对成骨分化具有促进作用，但确切的调控机制目前还不清楚。因此深入研究以上蛋白在骨改建过程中的具体作用，将有望阐明骨改建过程并揭示骨代谢疾病的分子机制，这对于进一步提高骨疾病的治疗效果具有重要意义。

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中国修复重建外科杂志