引用本文： 代广春, 李荥娟, 徐宏亮, 林禹丞, 刘俊延, 徐林, 芮云峰. 深低温冷冻对大鼠髌腱组织内肌腱干细胞生物学特性影响的研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(7): 845-852. doi: 10.7507/1002-1892.201703033 复制
肌腱损伤是运动系统最常见损伤之一，发病率逐年上升。有研究显示，肌腱缺损占肌腱损伤的 25%[1]，其临床治疗效果欠佳，致残率较高，严重影响患者生活质量。既往关于肌腱缺损治疗方法的研究多集中于自体肌腱移植，该方法存在肌腱供区受损问题，增加患者痛苦。而同种异体肌腱来源广泛、取材方便，其生物结构和功能与自体肌腱完全相同，已成为应用最广泛的肌腱移植材料。目前，深低温冷冻是同种异体肌腱组织最常用的保存和处理方法[2]。早期研究认为，深低温冷冻处理后的同种异体肌腱组织中无活性细胞，仅作为生长支架[3]。但随着近年研究的深入，有学者发现深低温冷冻处理后的同种异体肌腱组织中仍存有活性肌腱细胞，且肌腱细胞能主动以内在性愈合方式参与到肌腱损伤愈合过程中[3-4]，提高缺损肌腱的愈合质量。研究发现，肌腱组织中包含具有多向分化潜能的肌腱干细胞（tendon-derived stem cells，TDSCs），其在维持肌腱稳态与修复肌腱损伤方面发挥了重要作用[5-9]。目前，有关深低温冷冻处理对同种异体肌腱组织中 TDSCs 活性的影响罕见报道。本研究中，我们以体外分离培养的大鼠髌腱 TDSCs 为研究对象，探究深低温冷冻处理对 TDSCs 细胞成活、细胞活力、细胞早期凋亡、细胞迁移能力及成肌腱相关基因表达的影响，以期为临床应用同种异体肌腱移植修复肌腱缺损提供相关理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4 月龄雄性 SD 大鼠 12 只，体质量 450～500 g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供。
L-DMEM 培养基、FBS、庆大霉素、链霉素、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；Trizol 试剂（Life Technologies 公司，美国）；Ⅰ型胶原酶、蔗糖（Sigma-Aldrich 公司，美国）；Alamar Blue（YEASON 公司，美国）；Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒（Vazyme 公司，美国）；PrimeScriptTM RT Master Mix 试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM（Takara 公司，日本）；实时荧光定量 PCR 引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。
V370 扫描仪（EPSON 公司，日本）；细胞培养箱、分光光度计、酶联免疫检测仪（Thermo Fisher 公司，美国）；FACS Calibur 流式细胞仪（BD Biosciences 公司，美国）；实时荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems 公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；6.5 mm Transwell 小室（孔径 8 μm）（Sigma-Aldrich 公司，美国）。
1.2 大鼠髌腱组织处理
随机取 6 只 SD 大鼠引颈法处死，取双侧髌腱，剔除肌腱组织表面腱膜及腱-骨、腱-肌交界部位；生理盐水冲洗后，置入含 10%DMSO、0.1 mol/L 蔗糖的 FBS 冷冻保护液的细胞冻存管中[10]，置于 4℃ 冰箱 2 h 后转至–80℃ 冰箱，以 1℃/min 的恒定速率降温至–80℃，过夜，转至液氮中保存 7 d；取出并立即置入 37℃ 水浴中快速复温，待冻存管中液体融解（<2 min）后，于无菌条件下将肌腱依次置入 1.0、0.5、0.25 mmol/L 蔗糖溶液（4℃）中各 5 min，间隔 10 min；最后，将深低温冷冻处理的肌腱保存在含 10%FBS 的 L-DMEM 培养基中。另取 6 只大鼠，同上法麻醉、取出双侧髌腱后，直接置于含 10%FBS 的 L-DMEM 培养基中。
1.3 TDSCs 的分离及培养
参照本课题组前期经验及方法[6]分离培养大鼠 TDSCs。无菌条件下，分别取 1.2 中获得的深低温冷冻处理髌腱组织（实验组）及正常髌腱组织（对照组），PBS 冲洗，取中段组织，用眼科剪将其剪成 1 mm×1 mm×1 mm 小块，置于含 4～5 mL 0.3%Ⅰ型胶原酶的 15 mL 离心管中，两种髌腱组织各 12 条，可分成 5～6 管；消化 2.5 h，每 30 分钟摇晃 1 次；待消化后，用 3 mL 吸管轻轻吹打后以 70 μm 细胞滤器过滤，收集单细胞悬液。PBS 洗涤 2 次，以 300×g 离心 5 min，去上清，用基础培养基（含 10%FBS、1% 双抗的 L-DMEM 培养基）重悬细胞。然后按 50 个/cm2 细胞密度接种至直径为 6 cm 的培养皿中，第 2 天首次换液，PBS 洗涤 2 次，移除未贴壁细胞。培养 7 d 左右用 0.25% 胰蛋白酶消化细胞并混合，标记为原代细胞。细胞铺满培养瓶底达 90% 后传代，弃培养液，PBS 洗涤 2 次，0.25% 胰蛋白酶消化 2～3 min，加入基础培养基终止消化，细胞悬液以 300×g 离心 5 min，弃上清，加入 2 mL 基础培养基重悬细胞并计数，按 5×103个/cm2 密度接种至培养瓶。取第 3 代细胞进行克隆形成能力及三系分化能力实验等，鉴定为 TDSCs 后用于实验[6]。
1.4 观测指标
1.4.1 深低温冷冻对肌腱组织有核细胞成活率的影响 采用锥虫蓝染色测定细胞成活率。取两组肌腱组织经 0.3%Ⅰ型胶原酶消化获得的有核细胞悬液置入 15 mL 离心管中，以 300×g 离心 3 min，弃上清，加入 2 mL PBS 重悬细胞。吸取 100 μL 重悬的细胞悬液至另一 15 mL 离心管内，加入 100 μL 锥虫蓝染色液，轻轻混匀，染色 5 min。吸取染色后的细胞悬液，用血细胞计数板计数，镜下见死细胞呈蓝染。按照以下公式计算细胞成活率：（细胞总数—蓝染细胞数）/细胞总数×100%。
1.4.2 深低温冷冻对肌腱组织有核细胞克隆集落形成的影响 取两组肌腱组织经 0.3%Ⅰ型胶原酶消化获得的有核细胞悬液，以 150 个/cm2 细胞密度接种于面积为 21 cm2 的培养皿中，置于普通细胞培养箱中培养，用基础培养基培养细胞，第 2 天首次换液，PBS 洗涤 2 次，移除未贴壁细胞。每 3 天换液 1 次，培养 12 d 后采用 0.5% 龙胆紫染色 15 min，观察细胞克隆集落形成情况，用 Image J 软件计算克隆集落形成数目，直径<2 mm 舍去。按照以下公式计算每 1 000 个有核细胞中克隆集落形成数：克隆集落形成数/有核细胞总数×1 000；计算 TDSCs 占活性有核细胞比例：每 1 000 个有核细胞中克隆集落形成数/（1 000×有核细胞成活率）×100%。其中，克隆集落形成数代表 TDSCs 数。
1.4.3 深低温冷冻对肌腱组织 TDSCs 细胞活力的影响 采用 Alamar Blue 法检测细胞活力。取两组第 3 代 TDSCs 接种至 96 孔板中，每孔 2×103个细胞，每组设 6 个复孔。每孔加入 100 μL 基础培养基，于普通细胞培养箱中培养。于培养 2、4、6、8、10、12、14 d，每孔加入 Alamar Blue 溶液 10 μL，37℃ 继续孵育 4 h 后终止培养，采用酶联免疫检测仪于 570 nm 测量各孔吸光度（A）值。检测完毕后，吸尽孔内培养上清液，PBS 清洗 3 次后，加入新鲜培养基 100 μL，继续培养至下一观测时间点，重复以上操作。
1.4.4 深低温冷冻对肌腱组织 TDSCs 细胞早期凋亡的影响 采用 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞早期凋亡率。取两组第 3 代 TDSCs，以 5×103个/cm2细胞密度接种至 6 孔板，每组设 3 个复孔。每孔加入 2.5 mL 基础培养基，于普通细胞培养箱中培养 3 d，待细胞融合达 80%～90% 后，用不含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶消化后收集细胞，用 4℃ 预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，每次洗涤按 4℃、300×g 离心 5 min 条件进行操作，最终收集（1～5）×105 个细胞。加入 100 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞，并加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI 染色液，轻轻混匀，避光、室温反应 10 min。加入 400 μL 1×Binding Buffer，轻轻混匀，采用 FACS Calibur 流式细胞仪，激发波长设为 488 nm，每管计数 1×104个细胞，流式细胞仪分选后，计算出对应右下象限的早期凋亡细胞，细胞早期凋亡率计算公式：早期凋亡细胞/细胞总数×100%。
1.4.5 深低温冷冻对 TDSCs 体外迁移能力的影响 采用 Transwell 法检测细胞体外迁移能力。取两组第 3 代 TDSCs，以 2×104 个/孔密度接种于 24 孔板 Transwell 的上室。上室每孔加入 100 μL 不含血清的 L-DMEM，下室每孔加入 600 μL 含 20%FBS 的 L-DMEM 培养基，每组设 6 个复孔。置于普通细胞培养箱中培养 36 h 后，轻轻移去培养基，PBS 清洗 3 次，用棉签擦去上室未穿孔的细胞；每孔加入 600 μL 甲醇固定 10 min；移去甲醇，每孔加入 600 μL 0.1% 结晶紫染液染色 20 min；移去结晶紫染液，PBS 清洗 3 次，每次 5 min，室温下晾干，小室翻转膜朝上，倒置相差显微镜观察并拍照。于 40 倍镜下随机选取 6 个视野拍照，用 Image J 软件计数迁移至滤膜下表面的细胞。
1.4.6 深低温冷冻对 TDSCs 肌腱相关基因表达的影响 采用实时荧光定量 PCR 检测Ⅰ型胶原（colla-gen type Ⅰ，Col1α1）、scleraxis（Scx）和 tenomodulin（Tnmd）的 mRNA 表达。取两组第 3 代 TDSCs，以 5×103 个/cm2 密度接种至 6 孔板中，每组设 6 个复孔，每孔加入 2.5 mL 基础培养基。于普通细胞培养箱中培养 3 d，待细胞融合达 80%～90% 后，每孔加 1 mL Trizol 提取总 RNA，根据 PrimeScriptTM RT Master Mix 试剂盒说明书反转录为 cDNA，参照 SYBR Premix Ex TaqTM 说明书进行实时荧光定量 PCR 扩增。以 β-actin 为内参，引物序列见表 1。反应体系为 SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，10 μmol/L 正反引物各 0.4 μL，加去离子水补足体积至 20 μL。反应条件：95℃、10 min 变性，进入扩增曲线，95℃、15 s，最佳退火温度 20 s，72℃、30 s，进行 40 个循环；进入溶解曲线，95℃、15 s，60℃、1 min，以 0.3℃/s 速度升到 95℃、15 s。Col1α1、Scx 和 Tnmd 的 mRNA 相对表达量用 2–△Ct表示，其中△Ct=Ct目的–Ct内参。
表1
目的基因引物序列、产物长度及退火温度
Table1.
Primer sequences, product size, and annealing temperature of target genes
1.5 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 深低温冷冻对肌腱组织有核细胞成活率的影响
对照组正常肌腱组织消化后，原代有核细胞绝大部分不着色，原代有核细胞成活率为 91.00%±3.63%。与对照组比较，实验组深低温冷冻组肌腱组织消化所得的原代有核细胞大部分不着色，原代有核细胞成活率为 61.65%±4.76%，组间细胞成活率比较差异有统计学意义（t=12.010，P=0.000）。
2.2 深低温冷冻对肌腱组织有核细胞克隆集落形成的影响
两组有核细胞接种后，均呈克隆样生长（图 1）；培养 12 d，实验组每 1 000 个有核细胞克隆集落形成数为（8.41±0.33）个，较对照组（15.19±0.47）个显著减少，比较差异有统计学意义（t=28.910，P=0.000）；实验组 TDSCs 占活性有核细胞比例为 1.37%±0.09%，较对照组 1.67%±0.10% 显著减少，比较差异有统计学意义（t=5.508，P=0.003）。
图1
两组培养 12 d 有核细胞克隆集落形成观察
a. 实验组；b. 对照组
Figure1. Observation of nucleated cells clones in 2 groups after cultured for 12 daysa. Experimental group; b. Control group
2.3 深低温冷冻对肌腱组织 TDSCs 细胞活力的影响
培养 14 d 内观察，两组细胞生长趋势一致；培养前 8 d 细胞均呈平稳增长趋势，8～12 d 为生长加速期，12 d 后又趋于平稳。两组各时间点 A 值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图2
Alamar Blue 法检测两组细胞活力
Figure2.
Cell viability in 2 groups by Alamar Blue method
2.4 深低温冷冻对肌腱组织 TDSCs 细胞早期凋亡的影响
实验组及对照组 TDSCs 早期凋亡率分别为 1.67%±0.06%、1.63%±0.06%，比较差异无统计学意义（t=0.707，P=0.519）。见图 3。
图3
流式细胞仪检测两组 TDSCs 早期凋亡
a. 实验组；b. 对照组
Figure3. Early apoptosis of TDSCs in 2 groups by flow cytometrya. Experimental group; b. Control group
2.5 深低温冷冻对 TDSCs 体外迁移能力的影响
镜下见，两组均有 TDSCs 黏附于 Transwell 小室下室（图 4），且黏附于 Transwell 小室下室面的细胞均明显多于漏出到孔板中的细胞。实验组细胞数为（445.00±9.70）个，对照组为（451.50±12.66）个，比较差异无统计学意义（t=0.998，P=0.342）。
图4
两组培养 3 d 后细胞迁移观察（倒置相差显微镜×40）
a. 实验组；b. 对照组
Figure4. Observation of cell migration in 2 groups after cultured for 3 days (Inverted phase contrast microscope×40)a. Experimental group; b. Control group
2.6 深低温冷冻对 TDSCs 肌腱相关基因表达的影响
实验组 Col1α1、Scx、Tnmd 的 mRNA 相对表达量分别为 3.498±0.065、0.062±0.002、（4.211±0.211）×10–5，对照组分别为 3.499±0.113、0.062±0.001、（4.341±0.274）×10–5，比较差异均无统计学意义（t=0.013，P=0.991；t=0.042，P=0.969；t=0.653，P=0.549）。
3 讨论
目前，深低温冷冻处理是目前应用最广泛且最有效的保存同种异体肌腱组织的方法[11]。深低温冷冻处理过程中受多种因素影响，如被保存物体大小、冷冻速率、冷冻保护剂、冷冻保存时间等[12-15]，其中，冷冻保护剂是冷冻成败的关键之一[12]。冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类，目前多联合使用两种以上冷冻保护剂组成的保护液，以降低保护剂本身毒性，同时提高冷冻保护效率。本实验选择渗透性的 DMSO 和非渗透性的蔗糖加入 FBS 中作为冷冻保护剂，以达到更好的冷冻效果[10]。前期研究多将肌腱组织保存在液氮中 1 周左右，或者 2 周甚至更长，结果显示肌腱组织免疫原性降低，但生物力学性能等方面无显著变化[4, 16-17]。张发惠等[15]的研究将兔小腿肌腱给予不同冷冻时间处理，结果显示冷冻储存 360 d 组的肌腱破坏荷载和肌腱延伸率较对照组显著下降，而其余低于 360 d 处理时间组与对照组比较均无明显变化，提示短时间冷冻储存不会影响肌腱组织力学性能。因此，本研究选择于液氮中保存 7 d。
研究表明，深低温冷冻技术用于保存椎间盘、皮肤等组织时，组织经深低温冷冻后均有细胞存活[18-20]。本实验中，两组肌腱组织均检测到有活性的肌腱细胞，但实验组原代有核细胞成活率显著低于对照组，提示深低温冷冻处理过程中会造成部分细胞损伤死亡。但经过深低温冷冻处理后，肌腱组织中仍有细胞存活，当肌腱组织植入机体内，存活的细胞会在肌腱组织的修复及愈合过程中发挥作用。结合研究结果分析，提示深低温冷冻处理可用于保存肌腱组织，且冷冻后组织中有活性腱细胞。
学者们分别从大鼠﹑小鼠和人肌腱组织中成功分离 TDSCs，证实在多个物种肌腱组织中除肌腱细胞外，还存在一群具有克隆形成能力﹑自我更新以及多向分化潜能的MSCs群[6, 21]。成体干细胞在组织内以保持沉默态和处于激活态两种方式并存，在维持组织平衡和参与组织损伤修复方面发挥作用[5]。在生理状态细胞发生更替或肌腱组织遭受创伤正常愈合时，TDSCs 被激活，通过成肌腱分化定向分化为肌腱细胞，对自身特异性组织中已经分化的肌腱起到维持﹑再生和替代的作用[22]。这种 TDSCs 的分化将促进受损肌腱组织的愈合修复[5-9, 21-22]。鉴于 TDSCs 在肌腱组织损伤修复过程中的重要作用，有必要对其生物学特性等方面进行研究。
本课题组既往研究发现，将肌腱组织消化所得有核细胞以较低密度接种到培养皿后，干细胞增殖相对较快，在培养皿中呈克隆集落样贴壁生长[6]。本实验按此步骤将两组肌腱组织消化所得的有核细胞进行相同条件培养后，均呈克隆样生长，形成细胞簇，实验组细胞克隆集落形成数少于对照组，表明冷冻过程中，肌腱组织消化所得有核细胞中有干性细胞的存在，但数目较正常肌腱组织减少。实验组 TDSCs 占活性有核细胞比例较对照组降低，说明 TDSCs 在深低温冷冻过程中易受损伤。
干细胞生长至第 1 代过程中，细胞中存在具有不同细胞形态及细胞表型的其他细胞，传代至第 3 代时，细胞主要表现为均一的具有成纤维细胞特征的长梭形，高表达具有 MSCs 特性的表面标志物，具有克隆形成、体外增殖能力以及多向分化的能力[6]。因此，本实验选择第 3 代 TDSCs 进行相关实验。细胞活力是检测细胞生物学特性常用指标之一，Alamar Blue 对细胞无毒、无害，几乎不干扰细胞正常代谢[23]，所我们利用 Alamar Blue 法比较两组 TDSCs 相同条件培养 14 d 后的细胞活力。结果显示，培养 14 d 内两组细胞生长过程可分成 3 个时间段，与细胞正常生长过程相符合，即分为细胞生长滞留期、指数增殖期及平台期 3 个时期。两组各时间点 A 值比较差异无统计学意义，可见深低温冷冻处理后的 TDSCs 细胞活力可恢复至正常水平。Annexin V-FITC/PI 双染法结果显示，两组 TDSCs 早期凋亡率差异无统计学意义。细胞凋亡是为了维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、有序的死亡，也是细胞生长、代谢、增殖能力指标之一。本实验结果说明，经深低温冷冻处理后的 TDSCs 生长过程中分裂增殖和代谢等能力可恢复至正常细胞水平。细胞迁移能力是细胞正常基本功能之一，是活细胞普遍存在的一种运动形式，也因细胞迁移独有的运动特性，成为细胞生物学特性研究热点之一。细胞迁移主要受细胞内肌动蛋白细胞骨架和其动力学性能及细胞外基质影响[24-25]。实验组 TDSCs 迁移能力与对照组相似，且 TDSCs 合成胞内蛋白及细胞外基质能力均可达正常水平。TDSCs 作为 MSCs 的一个类型，除了表达表面标志 CD44 和 CD90 等外，还高表达肌腱相关性基因，主要有 Col1α1、Scx、Tnmd、巢蛋白等[6, 21, 26]。肌腱组织主要由大量富含胶原纤维的结缔组织构成，Ⅰ 型胶原是胶原纤维主要成分，其中 Col1α1 是 Ⅰ 型胶原合成的第 1 链，故选择 Col1α1 基因作为研究基质蛋白的目标基因。在胚胎发育过程中，Scx 是最早发现的 TDSCs 特异标志基因，Scx 基因敲除老鼠会出现严重的肌腱缺损，证实了在肌腱组织形成过程中 Scx 发挥着重要作用[27]。Tnmd 是 Ⅱ 型跨膜蛋白新的一员，常高表达于肌腱、韧带和眼睛部位，低表达于胸腺、心脏和肝脏等组织中，Tnmd 基因敲除鼠的新生肌腱组织中增殖细胞严重减少，细胞密度减低，胶原纤维排列紊乱，由此可见 Tnmd 是肌腱组织发育过程中的重要标志，在肌腱细胞增殖和胶原纤维成熟中起重要调节作用[28-29]。因此，我们选择检测 Col1α1、Scx、Tnmd 基因相对表达量来代表细胞外基质合成与成肌腱分化转录基因的表达，结果实验组以上指标与对照组无显著差异。与 Brandau 等[30]研究认为深低温冷冻处理后细胞 Tnmd mRNA 的高表达不同，本实验组 Tnmd 的 mRNA 相对表达量较低，但两组表达均低，无明显差异，说明深低温冷冻处理后的 TDSCs 其成肌腱分化能力可恢复至正常水平。
TDSCs 在肌腱损伤修复过程中起着重要作用，其可通过成肌腱定向分化为肌腱细胞，与肌腱细胞一起通过合成分泌胶原纤维，重塑肌腱纤维结构，以此维持肌腱的正常生理功能。同种异体肌腱组织经深低温冷冻可以保存肌腱纤维结缔组织，可提供一个良好的“胶原纤维支架”。本实验成功从深低温冷冻处理后的肌腱组织中提取 TDSCs，且与正常细胞相比生物学特性无显著差异，仍能定向成肌腱分化为肌腱细胞，提示以原有纤维为支架，可能会更高效地促进肌腱组织损伤的愈合。然而，影响同种异体肌腱组织植入机体后发挥作用的因素很多，后续实验需要研究冷冻同种异体肌腱组织应用于机体的免疫原性、组织学及生物力学的变化，以期为同种异体肌腱组织组织在肌腱缺损中的应用提供完整的理论依据。
肌腱损伤是运动系统最常见损伤之一，发病率逐年上升。有研究显示，肌腱缺损占肌腱损伤的 25%[1]，其临床治疗效果欠佳，致残率较高，严重影响患者生活质量。既往关于肌腱缺损治疗方法的研究多集中于自体肌腱移植，该方法存在肌腱供区受损问题，增加患者痛苦。而同种异体肌腱来源广泛、取材方便，其生物结构和功能与自体肌腱完全相同，已成为应用最广泛的肌腱移植材料。目前，深低温冷冻是同种异体肌腱组织最常用的保存和处理方法[2]。早期研究认为，深低温冷冻处理后的同种异体肌腱组织中无活性细胞，仅作为生长支架[3]。但随着近年研究的深入，有学者发现深低温冷冻处理后的同种异体肌腱组织中仍存有活性肌腱细胞，且肌腱细胞能主动以内在性愈合方式参与到肌腱损伤愈合过程中[3-4]，提高缺损肌腱的愈合质量。研究发现，肌腱组织中包含具有多向分化潜能的肌腱干细胞（tendon-derived stem cells，TDSCs），其在维持肌腱稳态与修复肌腱损伤方面发挥了重要作用[5-9]。目前，有关深低温冷冻处理对同种异体肌腱组织中 TDSCs 活性的影响罕见报道。本研究中，我们以体外分离培养的大鼠髌腱 TDSCs 为研究对象，探究深低温冷冻处理对 TDSCs 细胞成活、细胞活力、细胞早期凋亡、细胞迁移能力及成肌腱相关基因表达的影响，以期为临床应用同种异体肌腱移植修复肌腱缺损提供相关理论依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物及主要试剂、仪器
4 月龄雄性 SD 大鼠 12 只，体质量 450～500 g，由常州卡文斯实验动物有限公司提供。
L-DMEM 培养基、FBS、庆大霉素、链霉素、胰蛋白酶（GIBCO 公司，美国）；Trizol 试剂（Life Technologies 公司，美国）；Ⅰ型胶原酶、蔗糖（Sigma-Aldrich 公司，美国）；Alamar Blue（YEASON 公司，美国）；Annexin V-FITC/PI 凋亡试剂盒（Vazyme 公司，美国）；PrimeScriptTM RT Master Mix 试剂盒、SYBR Premix Ex TaqTM（Takara 公司，日本）；实时荧光定量 PCR 引物（上海捷瑞生物工程有限公司）。
V370 扫描仪（EPSON 公司，日本）；细胞培养箱、分光光度计、酶联免疫检测仪（Thermo Fisher 公司，美国）；FACS Calibur 流式细胞仪（BD Biosciences 公司，美国）；实时荧光定量 PCR 仪（Applied Biosystems 公司，美国）；倒置相差显微镜（Olympus 公司，日本）；6.5 mm Transwell 小室（孔径 8 μm）（Sigma-Aldrich 公司，美国）。
1.2 大鼠髌腱组织处理
随机取 6 只 SD 大鼠引颈法处死，取双侧髌腱，剔除肌腱组织表面腱膜及腱-骨、腱-肌交界部位；生理盐水冲洗后，置入含 10%DMSO、0.1 mol/L 蔗糖的 FBS 冷冻保护液的细胞冻存管中[10]，置于 4℃ 冰箱 2 h 后转至–80℃ 冰箱，以 1℃/min 的恒定速率降温至–80℃，过夜，转至液氮中保存 7 d；取出并立即置入 37℃ 水浴中快速复温，待冻存管中液体融解（<2 min）后，于无菌条件下将肌腱依次置入 1.0、0.5、0.25 mmol/L 蔗糖溶液（4℃）中各 5 min，间隔 10 min；最后，将深低温冷冻处理的肌腱保存在含 10%FBS 的 L-DMEM 培养基中。另取 6 只大鼠，同上法麻醉、取出双侧髌腱后，直接置于含 10%FBS 的 L-DMEM 培养基中。
1.3 TDSCs 的分离及培养
参照本课题组前期经验及方法[6]分离培养大鼠 TDSCs。无菌条件下，分别取 1.2 中获得的深低温冷冻处理髌腱组织（实验组）及正常髌腱组织（对照组），PBS 冲洗，取中段组织，用眼科剪将其剪成 1 mm×1 mm×1 mm 小块，置于含 4～5 mL 0.3%Ⅰ型胶原酶的 15 mL 离心管中，两种髌腱组织各 12 条，可分成 5～6 管；消化 2.5 h，每 30 分钟摇晃 1 次；待消化后，用 3 mL 吸管轻轻吹打后以 70 μm 细胞滤器过滤，收集单细胞悬液。PBS 洗涤 2 次，以 300×g 离心 5 min，去上清，用基础培养基（含 10%FBS、1% 双抗的 L-DMEM 培养基）重悬细胞。然后按 50 个/cm2 细胞密度接种至直径为 6 cm 的培养皿中，第 2 天首次换液，PBS 洗涤 2 次，移除未贴壁细胞。培养 7 d 左右用 0.25% 胰蛋白酶消化细胞并混合，标记为原代细胞。细胞铺满培养瓶底达 90% 后传代，弃培养液，PBS 洗涤 2 次，0.25% 胰蛋白酶消化 2～3 min，加入基础培养基终止消化，细胞悬液以 300×g 离心 5 min，弃上清，加入 2 mL 基础培养基重悬细胞并计数，按 5×103个/cm2 密度接种至培养瓶。取第 3 代细胞进行克隆形成能力及三系分化能力实验等，鉴定为 TDSCs 后用于实验[6]。
1.4 观测指标
1.4.1 深低温冷冻对肌腱组织有核细胞成活率的影响 采用锥虫蓝染色测定细胞成活率。取两组肌腱组织经 0.3%Ⅰ型胶原酶消化获得的有核细胞悬液置入 15 mL 离心管中，以 300×g 离心 3 min，弃上清，加入 2 mL PBS 重悬细胞。吸取 100 μL 重悬的细胞悬液至另一 15 mL 离心管内，加入 100 μL 锥虫蓝染色液，轻轻混匀，染色 5 min。吸取染色后的细胞悬液，用血细胞计数板计数，镜下见死细胞呈蓝染。按照以下公式计算细胞成活率：（细胞总数—蓝染细胞数）/细胞总数×100%。
1.4.2 深低温冷冻对肌腱组织有核细胞克隆集落形成的影响 取两组肌腱组织经 0.3%Ⅰ型胶原酶消化获得的有核细胞悬液，以 150 个/cm2 细胞密度接种于面积为 21 cm2 的培养皿中，置于普通细胞培养箱中培养，用基础培养基培养细胞，第 2 天首次换液，PBS 洗涤 2 次，移除未贴壁细胞。每 3 天换液 1 次，培养 12 d 后采用 0.5% 龙胆紫染色 15 min，观察细胞克隆集落形成情况，用 Image J 软件计算克隆集落形成数目，直径<2 mm 舍去。按照以下公式计算每 1 000 个有核细胞中克隆集落形成数：克隆集落形成数/有核细胞总数×1 000；计算 TDSCs 占活性有核细胞比例：每 1 000 个有核细胞中克隆集落形成数/（1 000×有核细胞成活率）×100%。其中，克隆集落形成数代表 TDSCs 数。
1.4.3 深低温冷冻对肌腱组织 TDSCs 细胞活力的影响 采用 Alamar Blue 法检测细胞活力。取两组第 3 代 TDSCs 接种至 96 孔板中，每孔 2×103个细胞，每组设 6 个复孔。每孔加入 100 μL 基础培养基，于普通细胞培养箱中培养。于培养 2、4、6、8、10、12、14 d，每孔加入 Alamar Blue 溶液 10 μL，37℃ 继续孵育 4 h 后终止培养，采用酶联免疫检测仪于 570 nm 测量各孔吸光度（A）值。检测完毕后，吸尽孔内培养上清液，PBS 清洗 3 次后，加入新鲜培养基 100 μL，继续培养至下一观测时间点，重复以上操作。
1.4.4 深低温冷冻对肌腱组织 TDSCs 细胞早期凋亡的影响 采用 Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞早期凋亡率。取两组第 3 代 TDSCs，以 5×103个/cm2细胞密度接种至 6 孔板，每组设 3 个复孔。每孔加入 2.5 mL 基础培养基，于普通细胞培养箱中培养 3 d，待细胞融合达 80%～90% 后，用不含 EDTA 的 0.25% 胰蛋白酶消化后收集细胞，用 4℃ 预冷的 PBS 洗涤细胞 2 次，每次洗涤按 4℃、300×g 离心 5 min 条件进行操作，最终收集（1～5）×105 个细胞。加入 100 μL 1×Binding Buffer 重悬细胞，并加入 5 μL Annexin V-FITC 和 5 μL PI 染色液，轻轻混匀，避光、室温反应 10 min。加入 400 μL 1×Binding Buffer，轻轻混匀，采用 FACS Calibur 流式细胞仪，激发波长设为 488 nm，每管计数 1×104个细胞，流式细胞仪分选后，计算出对应右下象限的早期凋亡细胞，细胞早期凋亡率计算公式：早期凋亡细胞/细胞总数×100%。
1.4.5 深低温冷冻对 TDSCs 体外迁移能力的影响 采用 Transwell 法检测细胞体外迁移能力。取两组第 3 代 TDSCs，以 2×104 个/孔密度接种于 24 孔板 Transwell 的上室。上室每孔加入 100 μL 不含血清的 L-DMEM，下室每孔加入 600 μL 含 20%FBS 的 L-DMEM 培养基，每组设 6 个复孔。置于普通细胞培养箱中培养 36 h 后，轻轻移去培养基，PBS 清洗 3 次，用棉签擦去上室未穿孔的细胞；每孔加入 600 μL 甲醇固定 10 min；移去甲醇，每孔加入 600 μL 0.1% 结晶紫染液染色 20 min；移去结晶紫染液，PBS 清洗 3 次，每次 5 min，室温下晾干，小室翻转膜朝上，倒置相差显微镜观察并拍照。于 40 倍镜下随机选取 6 个视野拍照，用 Image J 软件计数迁移至滤膜下表面的细胞。
1.4.6 深低温冷冻对 TDSCs 肌腱相关基因表达的影响 采用实时荧光定量 PCR 检测Ⅰ型胶原（colla-gen type Ⅰ，Col1α1）、scleraxis（Scx）和 tenomodulin（Tnmd）的 mRNA 表达。取两组第 3 代 TDSCs，以 5×103 个/cm2 密度接种至 6 孔板中，每组设 6 个复孔，每孔加入 2.5 mL 基础培养基。于普通细胞培养箱中培养 3 d，待细胞融合达 80%～90% 后，每孔加 1 mL Trizol 提取总 RNA，根据 PrimeScriptTM RT Master Mix 试剂盒说明书反转录为 cDNA，参照 SYBR Premix Ex TaqTM 说明书进行实时荧光定量 PCR 扩增。以 β-actin 为内参，引物序列见表 1。反应体系为 SYBR Premix Ex TaqTM 10 μL，10 μmol/L 正反引物各 0.4 μL，加去离子水补足体积至 20 μL。反应条件：95℃、10 min 变性，进入扩增曲线，95℃、15 s，最佳退火温度 20 s，72℃、30 s，进行 40 个循环；进入溶解曲线，95℃、15 s，60℃、1 min，以 0.3℃/s 速度升到 95℃、15 s。Col1α1、Scx 和 Tnmd 的 mRNA 相对表达量用 2–△Ct表示，其中△Ct=Ct目的–Ct内参。
表1
目的基因引物序列、产物长度及退火温度
Table1.
Primer sequences, product size, and annealing temperature of target genes
1.5 统计学方法
采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 深低温冷冻对肌腱组织有核细胞成活率的影响
对照组正常肌腱组织消化后，原代有核细胞绝大部分不着色，原代有核细胞成活率为 91.00%±3.63%。与对照组比较，实验组深低温冷冻组肌腱组织消化所得的原代有核细胞大部分不着色，原代有核细胞成活率为 61.65%±4.76%，组间细胞成活率比较差异有统计学意义（t=12.010，P=0.000）。
2.2 深低温冷冻对肌腱组织有核细胞克隆集落形成的影响
两组有核细胞接种后，均呈克隆样生长（图 1）；培养 12 d，实验组每 1 000 个有核细胞克隆集落形成数为（8.41±0.33）个，较对照组（15.19±0.47）个显著减少，比较差异有统计学意义（t=28.910，P=0.000）；实验组 TDSCs 占活性有核细胞比例为 1.37%±0.09%，较对照组 1.67%±0.10% 显著减少，比较差异有统计学意义（t=5.508，P=0.003）。
图1
两组培养 12 d 有核细胞克隆集落形成观察
a. 实验组；b. 对照组
Figure1. Observation of nucleated cells clones in 2 groups after cultured for 12 daysa. Experimental group; b. Control group
2.3 深低温冷冻对肌腱组织 TDSCs 细胞活力的影响
培养 14 d 内观察，两组细胞生长趋势一致；培养前 8 d 细胞均呈平稳增长趋势，8～12 d 为生长加速期，12 d 后又趋于平稳。两组各时间点 A 值比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图2
Alamar Blue 法检测两组细胞活力
Figure2.
Cell viability in 2 groups by Alamar Blue method
2.4 深低温冷冻对肌腱组织 TDSCs 细胞早期凋亡的影响
实验组及对照组 TDSCs 早期凋亡率分别为 1.67%±0.06%、1.63%±0.06%，比较差异无统计学意义（t=0.707，P=0.519）。见图 3。
图3
流式细胞仪检测两组 TDSCs 早期凋亡
a. 实验组；b. 对照组
Figure3. Early apoptosis of TDSCs in 2 groups by flow cytometrya. Experimental group; b. Control group
2.5 深低温冷冻对 TDSCs 体外迁移能力的影响
镜下见，两组均有 TDSCs 黏附于 Transwell 小室下室（图 4），且黏附于 Transwell 小室下室面的细胞均明显多于漏出到孔板中的细胞。实验组细胞数为（445.00±9.70）个，对照组为（451.50±12.66）个，比较差异无统计学意义（t=0.998，P=0.342）。
图4
两组培养 3 d 后细胞迁移观察（倒置相差显微镜×40）
a. 实验组；b. 对照组
Figure4. Observation of cell migration in 2 groups after cultured for 3 days (Inverted phase contrast microscope×40)a. Experimental group; b. Control group
2.6 深低温冷冻对 TDSCs 肌腱相关基因表达的影响
实验组 Col1α1、Scx、Tnmd 的 mRNA 相对表达量分别为 3.498±0.065、0.062±0.002、（4.211±0.211）×10–5，对照组分别为 3.499±0.113、0.062±0.001、（4.341±0.274）×10–5，比较差异均无统计学意义（t=0.013，P=0.991；t=0.042，P=0.969；t=0.653，P=0.549）。
3 讨论
目前，深低温冷冻处理是目前应用最广泛且最有效的保存同种异体肌腱组织的方法[11]。深低温冷冻处理过程中受多种因素影响，如被保存物体大小、冷冻速率、冷冻保护剂、冷冻保存时间等[12-15]，其中，冷冻保护剂是冷冻成败的关键之一[12]。冷冻保护剂可分为渗透性和非渗透性两类，目前多联合使用两种以上冷冻保护剂组成的保护液，以降低保护剂本身毒性，同时提高冷冻保护效率。本实验选择渗透性的 DMSO 和非渗透性的蔗糖加入 FBS 中作为冷冻保护剂，以达到更好的冷冻效果[10]。前期研究多将肌腱组织保存在液氮中 1 周左右，或者 2 周甚至更长，结果显示肌腱组织免疫原性降低，但生物力学性能等方面无显著变化[4, 16-17]。张发惠等[15]的研究将兔小腿肌腱给予不同冷冻时间处理，结果显示冷冻储存 360 d 组的肌腱破坏荷载和肌腱延伸率较对照组显著下降，而其余低于 360 d 处理时间组与对照组比较均无明显变化，提示短时间冷冻储存不会影响肌腱组织力学性能。因此，本研究选择于液氮中保存 7 d。
研究表明，深低温冷冻技术用于保存椎间盘、皮肤等组织时，组织经深低温冷冻后均有细胞存活[18-20]。本实验中，两组肌腱组织均检测到有活性的肌腱细胞，但实验组原代有核细胞成活率显著低于对照组，提示深低温冷冻处理过程中会造成部分细胞损伤死亡。但经过深低温冷冻处理后，肌腱组织中仍有细胞存活，当肌腱组织植入机体内，存活的细胞会在肌腱组织的修复及愈合过程中发挥作用。结合研究结果分析，提示深低温冷冻处理可用于保存肌腱组织，且冷冻后组织中有活性腱细胞。
学者们分别从大鼠﹑小鼠和人肌腱组织中成功分离 TDSCs，证实在多个物种肌腱组织中除肌腱细胞外，还存在一群具有克隆形成能力﹑自我更新以及多向分化潜能的MSCs群[6, 21]。成体干细胞在组织内以保持沉默态和处于激活态两种方式并存，在维持组织平衡和参与组织损伤修复方面发挥作用[5]。在生理状态细胞发生更替或肌腱组织遭受创伤正常愈合时，TDSCs 被激活，通过成肌腱分化定向分化为肌腱细胞，对自身特异性组织中已经分化的肌腱起到维持﹑再生和替代的作用[22]。这种 TDSCs 的分化将促进受损肌腱组织的愈合修复[5-9, 21-22]。鉴于 TDSCs 在肌腱组织损伤修复过程中的重要作用，有必要对其生物学特性等方面进行研究。
本课题组既往研究发现，将肌腱组织消化所得有核细胞以较低密度接种到培养皿后，干细胞增殖相对较快，在培养皿中呈克隆集落样贴壁生长[6]。本实验按此步骤将两组肌腱组织消化所得的有核细胞进行相同条件培养后，均呈克隆样生长，形成细胞簇，实验组细胞克隆集落形成数少于对照组，表明冷冻过程中，肌腱组织消化所得有核细胞中有干性细胞的存在，但数目较正常肌腱组织减少。实验组 TDSCs 占活性有核细胞比例较对照组降低，说明 TDSCs 在深低温冷冻过程中易受损伤。
干细胞生长至第 1 代过程中，细胞中存在具有不同细胞形态及细胞表型的其他细胞，传代至第 3 代时，细胞主要表现为均一的具有成纤维细胞特征的长梭形，高表达具有 MSCs 特性的表面标志物，具有克隆形成、体外增殖能力以及多向分化的能力[6]。因此，本实验选择第 3 代 TDSCs 进行相关实验。细胞活力是检测细胞生物学特性常用指标之一，Alamar Blue 对细胞无毒、无害，几乎不干扰细胞正常代谢[23]，所我们利用 Alamar Blue 法比较两组 TDSCs 相同条件培养 14 d 后的细胞活力。结果显示，培养 14 d 内两组细胞生长过程可分成 3 个时间段，与细胞正常生长过程相符合，即分为细胞生长滞留期、指数增殖期及平台期 3 个时期。两组各时间点 A 值比较差异无统计学意义，可见深低温冷冻处理后的 TDSCs 细胞活力可恢复至正常水平。Annexin V-FITC/PI 双染法结果显示，两组 TDSCs 早期凋亡率差异无统计学意义。细胞凋亡是为了维持内环境稳定，由基因控制的细胞自主、有序的死亡，也是细胞生长、代谢、增殖能力指标之一。本实验结果说明，经深低温冷冻处理后的 TDSCs 生长过程中分裂增殖和代谢等能力可恢复至正常细胞水平。细胞迁移能力是细胞正常基本功能之一，是活细胞普遍存在的一种运动形式，也因细胞迁移独有的运动特性，成为细胞生物学特性研究热点之一。细胞迁移主要受细胞内肌动蛋白细胞骨架和其动力学性能及细胞外基质影响[24-25]。实验组 TDSCs 迁移能力与对照组相似，且 TDSCs 合成胞内蛋白及细胞外基质能力均可达正常水平。TDSCs 作为 MSCs 的一个类型，除了表达表面标志 CD44 和 CD90 等外，还高表达肌腱相关性基因，主要有 Col1α1、Scx、Tnmd、巢蛋白等[6, 21, 26]。肌腱组织主要由大量富含胶原纤维的结缔组织构成，Ⅰ 型胶原是胶原纤维主要成分，其中 Col1α1 是 Ⅰ 型胶原合成的第 1 链，故选择 Col1α1 基因作为研究基质蛋白的目标基因。在胚胎发育过程中，Scx 是最早发现的 TDSCs 特异标志基因，Scx 基因敲除老鼠会出现严重的肌腱缺损，证实了在肌腱组织形成过程中 Scx 发挥着重要作用[27]。Tnmd 是 Ⅱ 型跨膜蛋白新的一员，常高表达于肌腱、韧带和眼睛部位，低表达于胸腺、心脏和肝脏等组织中，Tnmd 基因敲除鼠的新生肌腱组织中增殖细胞严重减少，细胞密度减低，胶原纤维排列紊乱，由此可见 Tnmd 是肌腱组织发育过程中的重要标志，在肌腱细胞增殖和胶原纤维成熟中起重要调节作用[28-29]。因此，我们选择检测 Col1α1、Scx、Tnmd 基因相对表达量来代表细胞外基质合成与成肌腱分化转录基因的表达，结果实验组以上指标与对照组无显著差异。与 Brandau 等[30]研究认为深低温冷冻处理后细胞 Tnmd mRNA 的高表达不同，本实验组 Tnmd 的 mRNA 相对表达量较低，但两组表达均低，无明显差异，说明深低温冷冻处理后的 TDSCs 其成肌腱分化能力可恢复至正常水平。
TDSCs 在肌腱损伤修复过程中起着重要作用，其可通过成肌腱定向分化为肌腱细胞，与肌腱细胞一起通过合成分泌胶原纤维，重塑肌腱纤维结构，以此维持肌腱的正常生理功能。同种异体肌腱组织经深低温冷冻可以保存肌腱纤维结缔组织，可提供一个良好的“胶原纤维支架”。本实验成功从深低温冷冻处理后的肌腱组织中提取 TDSCs，且与正常细胞相比生物学特性无显著差异，仍能定向成肌腱分化为肌腱细胞，提示以原有纤维为支架，可能会更高效地促进肌腱组织损伤的愈合。然而，影响同种异体肌腱组织植入机体后发挥作用的因素很多，后续实验需要研究冷冻同种异体肌腱组织应用于机体的免疫原性、组织学及生物力学的变化，以期为同种异体肌腱组织组织在肌腱缺损中的应用提供完整的理论依据。
