代广春 1,2 , 李荥娟 3 , 徐宏亮 4 , 林禹丞 1 , 刘俊延 1,2 , 徐林 4 , 芮云峰 1,2,4
  • 1. 东南大学医学院附属中大医院骨科(南京 210000);
  • 2. 东南大学医学院(南京 210000);
  • 3. 东南大学医学院附属中大医院老年科(南京 210000);
  • 4. 东南大学医学院附属中大医院无锡分院骨科(江苏无锡 214000);
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目的探讨深低温冷冻处理对大鼠髌腱组织中肌腱干细胞(tendon-derived stem cells,TDSCs)的成活、细胞活力、早期凋亡、迁移能力及肌腱相关基因表达的影响。方法取 12 只 4 月龄雄性 SD 大鼠双侧髌腱组织,其中 6 只大鼠 12 条髌腱组织(实验组)进行深低温冷冻处理;剩余髌腱组织(对照组)不作处理,作为正常对照。取两组髌腱组织用 0.3% Ⅰ 型胶原酶消化获得有核细胞,分别用锥虫蓝染色检测有核细胞成活率、结晶紫染色检测有核细胞克隆形成能力;取两组髌腱组织分离培养 TDSCs,并传至第 3 代,采用 Alamar Blue 法检测细胞体外增殖能力;Annexin V-FITC/PI 双染法检测细胞早期凋亡率;Transwell 法检测细胞迁移能力;实时荧光定量 PCR 检测细胞肌腱相关基因 Ⅰ 型胶原(collagen type Ⅰ,Col1α1)、scleraxis(Scx)和 tenomodulin(Tnmd) mRNA 表达。结果与对照组(91.00%±3.63%)比较,实验组原代有核细胞成活率为 61.65%±4.76%,差异有统计学意义(t=12.010,P=0.000)。两组有核细胞接种后,均呈克隆样生长;培养 12 d,实验组每 1 000 个有核细胞克隆集落形成数为(8.41±0.33)个,较对照组(15.19±0.47)个显著减少(t=28.910,P=0.000)。实验组 TDSCs 占活性有核细胞比例为 1.37%±0.09%,较对照组 1.67%±0.10% 显著减少(t=5.508,P=0.003)。第 3 代 TDSCs 培养 14 d 内两组细胞生长趋势一致;两组各时间点吸光度(A)值比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。实验组及对照组 TDSCs 早期凋亡率分别为 1.67%±0.06%、1.63%±0.06%,比较差异无统计学意义(t=0.707,P=0.519)。镜下见,两组均有 TDSCs 黏附于 Transwell 小室下室,实验组细胞数为(445.00±9.70)个,对照组为(451.50±12.66)个,比较差异无统计学意义(t=0.998,P=0.342)。实验组 Col1α1、Scx、Tnmd 的 mRNA 相对表达量分别为 3.498±0.065、0.062±0.002、(4.211±0.211)×10–5,对照组分别为 3.499±0.113、0.062±0.001、(4.341±0.274)×10–5,比较差异均无统计学意义(t=0.013,P=0.991;t=0.042,P=0.969;t=0.653,P=0.549)。结论大鼠肌腱组织经深低温冷冻后其有核细胞成活率降低,但肌腱组织仍保留大量有活性 TDSCs,且细胞增殖能力、早期凋亡率、体外迁移能力及成肌腱分化能力未见明显异常。

引用本文: 代广春, 李荥娟, 徐宏亮, 林禹丞, 刘俊延, 徐林, 芮云峰. 深低温冷冻对大鼠髌腱组织内肌腱干细胞生物学特性影响的研究. 中国修复重建外科杂志, 2017, 31(7): 845-852. doi: 10.7507/1002-1892.201703033 复制

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