引用本文： 张鹰, 贾帅军, 田方, 高新林, 王致远, 朱雷, 郝定均. 磷酸钙骨水泥复合透明质酸-姜黄素对成骨细胞增殖及成骨能力影响的研究. 中国修复重建外科杂志, 2021, 35(1): 104-110. doi: 10.7507/1002-1892.202007088 复制
随着我国人口老龄化逐渐加重，骨质疏松性椎体压缩骨折（osteoporotic vertebral compression fracture，OVCF）已成为威胁老年人健康的主要疾病之一[1]。椎体成形术是治疗 OVCF 的主要手段，通过向椎体内注入骨水泥迅速稳定损伤椎体，恢复椎体强度和高度[2-3]。磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）是 OVCF 中常用骨水泥类型，具有良好生物相容性、骨传导性、反应产热低以及可生物降解等优点[4]，但也存在力学强度较低、降解周期长及骨诱导性差等不足，限制了其在临床中的广泛应用[5]。针对上述不足对 CPC 进行改性成为研究热点。CPC 载药具有局部药物浓度高、全身毒副作用小、缓慢释放及持续时间长等[6-7]优点，因此目前通常采用 CPC 负载活性药物来增强其生物活性及骨诱导性。
姜黄素（curcumin，CUR）是从姜科植物姜黄、郁金、莪术等植物干燥根茎中提取的黄色酸性酚类物质，是姜黄发挥药理作用的主要活性成分[8]。CUR 具有抗炎[9]、抗病毒、抗感染和促成骨分化[10-11]等药理活性。为此，本研究拟在 CPC 中引入 CUR 以提高骨诱导能力，进而促进骨缺损愈合。但 CUR 水溶性差，直接应用于 CPC 中不利于其在生物体内吸收和利用。
透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种可生物降解、生物相容性好的大分子链状黏多糖，具有高度亲水性，存在可用于化学修饰的 4 个部位[12]，其中对羧基键的修饰最为常见。为提高 CUR 的生物利用度，本研究拟对 CUR 基团的羟基键与 HA 的羧基键成酯化共价结合制备 HA/CUR，改善 CUR 的水溶性，并将其与 CPC 复合后经体外实验检测对成骨细胞增殖及成骨能力的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
CUR（纯度≥95%）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐、透析袋（截留分子量为 3 500）、茜素红染液、ALP 染液、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、DAPI 溶液（北京索莱宝科技有限公司）；HA（相对分子质量 4.5×103；山东焦点生物科技有限公司）；4-二甲氨基吡啶、N，N-二甲基甲酰胺（上海麦克林生化科技有限公司）；自固化 CPC（上海瑞邦生物材料有限公司）；Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。
雷磁 pH 仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）；傅里叶变换红外光谱仪、超净工作台、酶标仪、低速离心机（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；倒置荧光显微镜（Leica 公司，德国）；扫描电镜（Phenom 公司，荷兰）；万能力学机（Instron 公司，美国）；维卡仪（无锡中科建材仪器有限公司）。
1.2 HA/CUR 的制备及观测
1.2.1 制备方法
称取 HA 413 mg（1.08 mmol）置于 100 mL 圆底烧瓶中，加入 10 mL 去离子水使其溶解，再加入 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐 207 mg（1.08 mmol）活化 30 min。称取 CUR 51.6 mg（0.54 mmol），加入 2.5 mL N，N-二甲基甲酰胺使其溶解。然后，将溶解的 CUR 加入制备的 HA 溶液中，加入 60 mg 4-二甲氨基吡啶反应 6 h 后用透析袋透析 24 h，每 2 小时更换 1 次透析水。透析结束后，将反应液转移至玻璃培养皿中，置于−40℃ 冰箱预冻过夜，第 2 天取出后冷冻干燥 24 h，最终获得呈淡黄色固体的 HA/CUR。
1.2.2 观测指标
大体观察 HA/CUR 水溶性，并采用 KBr 压片法用傅里叶变换红外光谱仪对样品进行表征检测，以 HA 作为对照。
1.3 复合骨水泥的制备及观测
1.3.1 制备方法
将自固化 CPC 充分混匀搅拌后，按 5%（W/W）分别添加 CUR、HA、HA/CUR，将糊状样品倒入直径 3 mm、高 5 mm 的聚四氟乙烯圆柱形模具中，固化 4 h 后从模具中取出，分别获得 CUR-CPC、HA-CPC、HA/CUR-CPC。
1.3.2 观测指标
① 凝结时间测试：采用维卡仪测量 CPC、CUR-CPC、HA-CPC、HA/CUR-CPC （n=6）初凝时间以及终凝时间。将盛有骨水泥浆体的圆柱形模具置于试针下，使试针与净浆面接触，拧紧螺丝。然后放松螺丝，使试针自由沉入净浆，观察指针读数。测试初凝时间时，试针长度 50 mm、直径 1.15 mm，每隔 5 min 测试 1 次；测试终凝时间时，试针长度 30 mm、直径 1.15 mm，每隔 15 min 测试 1 次。每次测试时，注意避免试针落入前次测量的针孔。
② 压缩强度测试：取单纯 CPC 及 3 种复合骨水泥圆柱形样本（n=3），采用万能力学机测量其压缩强度，载荷速度为 1 mm/min。
③ 可注射性能测试：取 5 mL 注射器称重并记为 m0；将搅拌均匀的单纯 CPC 及 3 种复合骨水泥浆体装入注射器，称重并记为 m1；推动注射器推杆挤出浆体至不能挤出为止，称量剩余浆体和注射器质量并记为 m2。按以下公式计算可注射率，公式：（m1−m2）/（m1−m0）×100%。重复测量 3 次。
④ 扫描电镜观察：取单纯 CPC 及 3 种复合骨水泥圆柱形样本，置于扫描电镜样品台上并连接导电胶、喷金处理，观察骨水泥微观形貌特性。
1.4 骨水泥复合成骨细胞培养及观测
1.4.1 成骨细胞分离及培养
取出生后 1～2 d 的 SD 大鼠（西安交通大学动物实验中心提供），断颈处死后置于 75% 乙醇浸泡 5 min，取颅骨以 PBS 缓冲液冲洗后，0.25% 胰蛋白酶消化，采用低速离心机以离心半径 40 cm、1 000 r/min 离心 5 min 后转移至培养瓶，加入成骨培养基（含 10%FBS、1% 青霉素/链霉素、10 mmol/L 甘油磷酸钠、0.1 μmol/L 地塞米松、50 mg/L 维生素 C 的 H-DMEM 培养基），置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱培养，培养 3 d 后换液，待细胞融合度达 80% 时进行传代培养。取第 2 代细胞进行后续实验。
1.4.2 骨水泥生物相容性检测
取单纯 CPC 以及 3 种复合骨水泥圆柱形样本，置于 75% 乙醇浸泡 6 h 消毒后，成骨培养基冲洗浸泡过夜。将密度为 1×104个/mL 的细胞悬液 0.5 mL 滴加至各骨水泥样本，然后置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱培养 48 h；取出 PBS 清洗 2～3 次，4% 戊二醛固定，扫描电镜观察细胞在骨水泥上黏附情况及形态。
1.4.3 活/死细胞荧光染色观察
同 1.4.2 方法将成骨细胞与 4 种骨水泥复合培养 3 d 后，采用 Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒行活/死细胞荧光染色，于倒置荧光显微镜 490 nm 波长下观察，其中活细胞为绿色荧光、死细胞为红色荧光，对活/死细胞进行计数，按以下公式计算细胞存活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。
1.4.4 成骨细胞增殖检测
同 1.4.2 方法将成骨细胞与 4 种骨水泥复合培养，于 24、48、72 h 后各取 3 孔采用 0.25% 胰蛋白酶消化后，吹打制成细胞悬液，采用细胞计数板进行细胞计数。
1.4.5 成骨能力检测
同 1.4.2 方法将成骨细胞与 4 种骨水泥复合培养，培养 48 h 行 OPN 免疫荧光染色，7 d 行 ALP 染色，21 d 行茜素红染色，观察成骨情况。
1.5 统计学方法
采用 SPSS25.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 HA/CUR 表征检测
CUR 难溶于水，沉淀明显；HA/CUR 溶于水，水溶液呈黄色。傅里叶变换红外光谱仪检测示，与 HA 相比，HA/CUR 红外图谱中 3 419.97 cm−1 处的峰变强，属于 CUR 结构中-OH 基团；2937.59 cm−1处的峰变强，属于 CUR 带有的双 C=O 官能团；在 1 651.07、1 508.33、1 226.73 cm−1 3 处出现了新峰，其中 1508.33 cm−1 的峰属于 CUR 中苯环内 C=C 的振动。结合 1 226.73、1 651.07 cm−1 处的峰可以判断酯键形成，表明 HA 已成功共价结合到 CUR 的分子骨架中。见图 1。
图1
HA/CUR 观测
a. 红外光谱图；b. CUR 颗粒与水混合物；c. HA/CUR 水溶液；d. HA/CUR-CPC
Figure1. HA/CUR observationa. Infrared spectrum; b. The mixture of CUR particles and water; c. HA/CUR solution; d. HA/CUR-CPC
2.2 复合骨水泥观测
2.2.1 凝结时间测试
HA/CUR-CPC 组初凝时间及终凝时间与 CPC 组、CUR-CPC 组、HA-CPC 组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图2
各组凝结时间
Figure2.
The setting time of each group
2.2.2 压缩强度测试
CPC 组、CUR-CPC 组、HA-CPC 组以及 HA/CUR-CPC 组压缩强度分别为（17.00±0.95）、（15.20±1.91）、（15.70±2.00）、（20.10±1.04）MPa，组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2.3 可注射性能测试
CPC 组、CUR-CPC 组、HA-CPC 组以及 HA/CUR-CPC 组可注射率分别为 89.20%±0.20%、76.20%±0.90%、82.70%±0.30%、85.30%±0.30%，HA/CUR-CPC 组可注射率与其他3 组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2.4 扫描电镜观察
扫描电镜观察见 HA/CUR-CPC 组材料较光滑，HA/CUR 散在分布于 CPC 表面，CPC 颗粒分布均匀，颗粒间结合较 CPC 组、CUR-CPC 组、HA-CPC 组更紧密。见图 3。
图3
各组骨水泥扫描电镜观察（×1 000）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure3. Scanning electron microscope observation of bone cement in each group (×1 000)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3 骨水泥复合成骨细胞培养观测
2.3.1 骨水泥生物相容性检测
成骨细胞与各组骨水泥复合培养 48 h 后，扫描电镜观察见成骨细胞黏附于各组骨水泥上，形态伸展良好，具有成骨细胞生长特征，其中 HA/CUR-CPC 组还有较多的细胞外基质产生。见图 4。
图4
各组骨水泥与成骨细胞共培养后扫描电镜观察（×800）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure4. Scanning electron microscope observation of bone cement in each group after co-cultured with osteoblasts (×800)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3.2 活/死细胞荧光染色观察
倒置荧光显微镜观察见各组骨水泥上有较多绿色荧光细胞。CPC 组、CUR-CPC 组、HA-CPC 组、HA/CUR-CPC 组细胞存活率分别为 98.33%±0.20%、98.65%±0.22%、98.66%±0.16%、99.08%±0.13%，组间差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
图5
倒置荧光显微镜观察各组细胞存活情况（×40）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure5. Inverted fluorescence microscope observation of cells survival in each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3.3 成骨细胞增殖观测
细胞计数检测显示，各时间点 HA/CUR-CPC 组细胞较其他 3 组明显增多，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6。
图6
各时间点各组细胞计数
Figure6.
Cell counting of each group at each time point
2.3.4 成骨能力检测
各组骨水泥与成骨细胞培养 48 h 后，OPN 免疫荧光染色显示 HA/CUR-CPC 组细胞绿色荧光强于其他组，且形态规则。见图 7。培养 7 d 后，ALP 染色显示各组细胞胞质中均可见淡蓝色小颗粒，提示细胞具有分泌 ALP 能力，符合成骨细胞生物学特征；其中 HA/CUR-CPC 组 ALP 表达强于其他组。见图 8。培养 21 d 后，茜素红染色显示各组均有深红色颗粒，且 HA/CUR-CPC 组明显多于其他组。见图 9。
图7
各组 OPN 免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×40）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure7. OPN immunofluorescence staining observation of each group (Inverted fluorescence microscope×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
图8
各组 ALP 染色观察（×40）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure8. ALP staining observation of each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
图9
各组茜素红染色观察（×40）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure9. Alizarin red staining observation of each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
3 讨论
近年来对 CPC 改性成为国内外学者研究热点，尤其是利用中成药改性的研究。比如韩愈等[13]采用淫羊藿苷与 CPC 形成蛋白载体来修复骨缺损；董航等[14]研究了载骨碎补总黄酮 CPC 对骨缺损模型大鼠诱导膜成骨分化的影响，结果显示载骨碎补总黄酮 CPC 通过激活 BMP-2/Smad 通路，调节成骨细胞分化，促进骨缺损模型大鼠诱导膜的成骨作用。
大量临床研究证实 CUR 具有广泛的药理作用，但对成骨细胞的作用研究较少，主要是因为 CUR 水溶性差，如何对 CUR 改性成为了首要问题。目前已有学者对 CUR 进行了改性，如 Landeros 等[15]以第 2 代聚酯枝晶（树枝化）对 CUR 酚基团进行改性，以达到最佳的亲水/疏水平衡，使新的 CUR 衍生物能在室温下完全水溶，并表现出良好稳定性。本研究引入 HA 对 CUR 进行改性，使 CUR 基团的羟基键与 HA 的羧基键共酯化结合。傅里叶变换红外光谱仪检测显示 HA 已成功共价结合到 CUR 的分子骨架，而且 HA/CUR 完全溶于水，表现出良好的水溶性。
CUR 改性后，本研究将 HA/CUR 与 CPC 进行复合，制备了 HA/CUR-CPC。可注射性测试及凝结时间测试显示，HA/CUR-CPC 在上述两个方面与单纯 CPC 相比均无显著差异，为其临床用于 OVCF 奠定了基础。另外，生物力学测试显示，HA/CUR-CPC 压缩强度约为 20 MPa，与单纯 CPC 相比差异无统计学意义，提示添加 HA/CUR 未影响 CPC 骨水泥的力学性能，可满足人体椎体的机械应力要求[16]，不影响其临床应用。
在物理性能检测基础上，本研究进一步将 HA/CUR-CPC 与成骨细胞复合培养，观察其生物相容性以及对成骨细胞成骨能力的影响。复合培养 48 h 后，与其他骨水泥相比，成骨细胞能较好地黏附于 HA/CUR-CPC 材料表面生长，且有较多的细胞外基质生成，提示 CUR 对细胞无毒性作用，对细胞增殖还有促进作用[17]。OPN 蛋白作为早期成骨标志物，能准确地表达早期成骨活性，免疫荧光染色显示成骨细胞在 HA/CUR-CPC 材料表面能分泌 OPN 蛋白，且明显优于其余骨水泥。ALP 的表达是成骨细胞在早期体外分化成熟的重要标志，ALP 染色示 HA/CUR-CPC 组 ALP 表达较其他组更显著。茜素红染色主要用于鉴定成骨分化能力，HA/CUR-CPC 组深红色钙化结节明显多于其他组。上述检测结果均表明 CPC 中添加 HA/CUR 可明显促进成骨细胞的成骨分化活性，且不影响成骨细胞增殖。
综上述， 与单纯 CPC 相比，HA/CUR-CPC 能显著促进成骨细胞增殖及提高其成骨能力，并且力学强度无明显下降，符合临床应用要求。后续我们将对其体内应用及相关分子机制作进一步探索。
作者贡献：郝定均、贾帅军、朱雷负责实验设计；张鹰负责实验实施、数据收集整理及统计分析、撰写文章；田方、高新林、王致远负责数据收集整理及统计分析；朱雷参与文章撰写。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经西安交通大学附属红会医院医学伦理委员会批准（202001010）。实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2018-001。
随着我国人口老龄化逐渐加重，骨质疏松性椎体压缩骨折（osteoporotic vertebral compression fracture，OVCF）已成为威胁老年人健康的主要疾病之一[1]。椎体成形术是治疗 OVCF 的主要手段，通过向椎体内注入骨水泥迅速稳定损伤椎体，恢复椎体强度和高度[2-3]。磷酸钙骨水泥（calcium phosphate cement，CPC）是 OVCF 中常用骨水泥类型，具有良好生物相容性、骨传导性、反应产热低以及可生物降解等优点[4]，但也存在力学强度较低、降解周期长及骨诱导性差等不足，限制了其在临床中的广泛应用[5]。针对上述不足对 CPC 进行改性成为研究热点。CPC 载药具有局部药物浓度高、全身毒副作用小、缓慢释放及持续时间长等[6-7]优点，因此目前通常采用 CPC 负载活性药物来增强其生物活性及骨诱导性。
姜黄素（curcumin，CUR）是从姜科植物姜黄、郁金、莪术等植物干燥根茎中提取的黄色酸性酚类物质，是姜黄发挥药理作用的主要活性成分[8]。CUR 具有抗炎[9]、抗病毒、抗感染和促成骨分化[10-11]等药理活性。为此，本研究拟在 CPC 中引入 CUR 以提高骨诱导能力，进而促进骨缺损愈合。但 CUR 水溶性差，直接应用于 CPC 中不利于其在生物体内吸收和利用。
透明质酸（hyaluronic acid，HA）是一种可生物降解、生物相容性好的大分子链状黏多糖，具有高度亲水性，存在可用于化学修饰的 4 个部位[12]，其中对羧基键的修饰最为常见。为提高 CUR 的生物利用度，本研究拟对 CUR 基团的羟基键与 HA 的羧基键成酯化共价结合制备 HA/CUR，改善 CUR 的水溶性，并将其与 CPC 复合后经体外实验检测对成骨细胞增殖及成骨能力的影响。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
CUR（纯度≥95%）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐、透析袋（截留分子量为 3 500）、茜素红染液、ALP 染液、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、DAPI 溶液（北京索莱宝科技有限公司）；HA（相对分子质量 4.5×103；山东焦点生物科技有限公司）；4-二甲氨基吡啶、N，N-二甲基甲酰胺（上海麦克林生化科技有限公司）；自固化 CPC（上海瑞邦生物材料有限公司）；Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。
雷磁 pH 仪（上海仪电科学仪器股份有限公司）；傅里叶变换红外光谱仪、超净工作台、酶标仪、低速离心机（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；倒置荧光显微镜（Leica 公司，德国）；扫描电镜（Phenom 公司，荷兰）；万能力学机（Instron 公司，美国）；维卡仪（无锡中科建材仪器有限公司）。
1.2 HA/CUR 的制备及观测
1.2.1 制备方法
称取 HA 413 mg（1.08 mmol）置于 100 mL 圆底烧瓶中，加入 10 mL 去离子水使其溶解，再加入 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺盐酸盐 207 mg（1.08 mmol）活化 30 min。称取 CUR 51.6 mg（0.54 mmol），加入 2.5 mL N，N-二甲基甲酰胺使其溶解。然后，将溶解的 CUR 加入制备的 HA 溶液中，加入 60 mg 4-二甲氨基吡啶反应 6 h 后用透析袋透析 24 h，每 2 小时更换 1 次透析水。透析结束后，将反应液转移至玻璃培养皿中，置于−40℃ 冰箱预冻过夜，第 2 天取出后冷冻干燥 24 h，最终获得呈淡黄色固体的 HA/CUR。
1.2.2 观测指标
大体观察 HA/CUR 水溶性，并采用 KBr 压片法用傅里叶变换红外光谱仪对样品进行表征检测，以 HA 作为对照。
1.3 复合骨水泥的制备及观测
1.3.1 制备方法
将自固化 CPC 充分混匀搅拌后，按 5%（W/W）分别添加 CUR、HA、HA/CUR，将糊状样品倒入直径 3 mm、高 5 mm 的聚四氟乙烯圆柱形模具中，固化 4 h 后从模具中取出，分别获得 CUR-CPC、HA-CPC、HA/CUR-CPC。
1.3.2 观测指标
① 凝结时间测试：采用维卡仪测量 CPC、CUR-CPC、HA-CPC、HA/CUR-CPC （n=6）初凝时间以及终凝时间。将盛有骨水泥浆体的圆柱形模具置于试针下，使试针与净浆面接触，拧紧螺丝。然后放松螺丝，使试针自由沉入净浆，观察指针读数。测试初凝时间时，试针长度 50 mm、直径 1.15 mm，每隔 5 min 测试 1 次；测试终凝时间时，试针长度 30 mm、直径 1.15 mm，每隔 15 min 测试 1 次。每次测试时，注意避免试针落入前次测量的针孔。
② 压缩强度测试：取单纯 CPC 及 3 种复合骨水泥圆柱形样本（n=3），采用万能力学机测量其压缩强度，载荷速度为 1 mm/min。
③ 可注射性能测试：取 5 mL 注射器称重并记为 m0；将搅拌均匀的单纯 CPC 及 3 种复合骨水泥浆体装入注射器，称重并记为 m1；推动注射器推杆挤出浆体至不能挤出为止，称量剩余浆体和注射器质量并记为 m2。按以下公式计算可注射率，公式：（m1−m2）/（m1−m0）×100%。重复测量 3 次。
④ 扫描电镜观察：取单纯 CPC 及 3 种复合骨水泥圆柱形样本，置于扫描电镜样品台上并连接导电胶、喷金处理，观察骨水泥微观形貌特性。
1.4 骨水泥复合成骨细胞培养及观测
1.4.1 成骨细胞分离及培养
取出生后 1～2 d 的 SD 大鼠（西安交通大学动物实验中心提供），断颈处死后置于 75% 乙醇浸泡 5 min，取颅骨以 PBS 缓冲液冲洗后，0.25% 胰蛋白酶消化，采用低速离心机以离心半径 40 cm、1 000 r/min 离心 5 min 后转移至培养瓶，加入成骨培养基（含 10%FBS、1% 青霉素/链霉素、10 mmol/L 甘油磷酸钠、0.1 μmol/L 地塞米松、50 mg/L 维生素 C 的 H-DMEM 培养基），置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱培养，培养 3 d 后换液，待细胞融合度达 80% 时进行传代培养。取第 2 代细胞进行后续实验。
1.4.2 骨水泥生物相容性检测
取单纯 CPC 以及 3 种复合骨水泥圆柱形样本，置于 75% 乙醇浸泡 6 h 消毒后，成骨培养基冲洗浸泡过夜。将密度为 1×104个/mL 的细胞悬液 0.5 mL 滴加至各骨水泥样本，然后置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱培养 48 h；取出 PBS 清洗 2～3 次，4% 戊二醛固定，扫描电镜观察细胞在骨水泥上黏附情况及形态。
1.4.3 活/死细胞荧光染色观察
同 1.4.2 方法将成骨细胞与 4 种骨水泥复合培养 3 d 后，采用 Calcein/PI 细胞活性与细胞毒性检测试剂盒行活/死细胞荧光染色，于倒置荧光显微镜 490 nm 波长下观察，其中活细胞为绿色荧光、死细胞为红色荧光，对活/死细胞进行计数，按以下公式计算细胞存活率：活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%。
1.4.4 成骨细胞增殖检测
同 1.4.2 方法将成骨细胞与 4 种骨水泥复合培养，于 24、48、72 h 后各取 3 孔采用 0.25% 胰蛋白酶消化后，吹打制成细胞悬液，采用细胞计数板进行细胞计数。
1.4.5 成骨能力检测
同 1.4.2 方法将成骨细胞与 4 种骨水泥复合培养，培养 48 h 行 OPN 免疫荧光染色，7 d 行 ALP 染色，21 d 行茜素红染色，观察成骨情况。
1.5 统计学方法
采用 SPSS25.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 HA/CUR 表征检测
CUR 难溶于水，沉淀明显；HA/CUR 溶于水，水溶液呈黄色。傅里叶变换红外光谱仪检测示，与 HA 相比，HA/CUR 红外图谱中 3 419.97 cm−1 处的峰变强，属于 CUR 结构中-OH 基团；2937.59 cm−1处的峰变强，属于 CUR 带有的双 C=O 官能团；在 1 651.07、1 508.33、1 226.73 cm−1 3 处出现了新峰，其中 1508.33 cm−1 的峰属于 CUR 中苯环内 C=C 的振动。结合 1 226.73、1 651.07 cm−1 处的峰可以判断酯键形成，表明 HA 已成功共价结合到 CUR 的分子骨架中。见图 1。
图1
HA/CUR 观测
a. 红外光谱图；b. CUR 颗粒与水混合物；c. HA/CUR 水溶液；d. HA/CUR-CPC
Figure1. HA/CUR observationa. Infrared spectrum; b. The mixture of CUR particles and water; c. HA/CUR solution; d. HA/CUR-CPC
2.2 复合骨水泥观测
2.2.1 凝结时间测试
HA/CUR-CPC 组初凝时间及终凝时间与 CPC 组、CUR-CPC 组、HA-CPC 组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 2。
图2
各组凝结时间
Figure2.
The setting time of each group
2.2.2 压缩强度测试
CPC 组、CUR-CPC 组、HA-CPC 组以及 HA/CUR-CPC 组压缩强度分别为（17.00±0.95）、（15.20±1.91）、（15.70±2.00）、（20.10±1.04）MPa，组间比较差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2.3 可注射性能测试
CPC 组、CUR-CPC 组、HA-CPC 组以及 HA/CUR-CPC 组可注射率分别为 89.20%±0.20%、76.20%±0.90%、82.70%±0.30%、85.30%±0.30%，HA/CUR-CPC 组可注射率与其他3 组比较，差异均无统计学意义（P>0.05）。
2.2.4 扫描电镜观察
扫描电镜观察见 HA/CUR-CPC 组材料较光滑，HA/CUR 散在分布于 CPC 表面，CPC 颗粒分布均匀，颗粒间结合较 CPC 组、CUR-CPC 组、HA-CPC 组更紧密。见图 3。
图3
各组骨水泥扫描电镜观察（×1 000）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure3. Scanning electron microscope observation of bone cement in each group (×1 000)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3 骨水泥复合成骨细胞培养观测
2.3.1 骨水泥生物相容性检测
成骨细胞与各组骨水泥复合培养 48 h 后，扫描电镜观察见成骨细胞黏附于各组骨水泥上，形态伸展良好，具有成骨细胞生长特征，其中 HA/CUR-CPC 组还有较多的细胞外基质产生。见图 4。
图4
各组骨水泥与成骨细胞共培养后扫描电镜观察（×800）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure4. Scanning electron microscope observation of bone cement in each group after co-cultured with osteoblasts (×800)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3.2 活/死细胞荧光染色观察
倒置荧光显微镜观察见各组骨水泥上有较多绿色荧光细胞。CPC 组、CUR-CPC 组、HA-CPC 组、HA/CUR-CPC 组细胞存活率分别为 98.33%±0.20%、98.65%±0.22%、98.66%±0.16%、99.08%±0.13%，组间差异均无统计学意义（P>0.05）。见图 5。
图5
倒置荧光显微镜观察各组细胞存活情况（×40）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure5. Inverted fluorescence microscope observation of cells survival in each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
2.3.3 成骨细胞增殖观测
细胞计数检测显示，各时间点 HA/CUR-CPC 组细胞较其他 3 组明显增多，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6。
图6
各时间点各组细胞计数
Figure6.
Cell counting of each group at each time point
2.3.4 成骨能力检测
各组骨水泥与成骨细胞培养 48 h 后，OPN 免疫荧光染色显示 HA/CUR-CPC 组细胞绿色荧光强于其他组，且形态规则。见图 7。培养 7 d 后，ALP 染色显示各组细胞胞质中均可见淡蓝色小颗粒，提示细胞具有分泌 ALP 能力，符合成骨细胞生物学特征；其中 HA/CUR-CPC 组 ALP 表达强于其他组。见图 8。培养 21 d 后，茜素红染色显示各组均有深红色颗粒，且 HA/CUR-CPC 组明显多于其他组。见图 9。
图7
各组 OPN 免疫荧光染色观察（倒置荧光显微镜×40）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure7. OPN immunofluorescence staining observation of each group (Inverted fluorescence microscope×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
图8
各组 ALP 染色观察（×40）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure8. ALP staining observation of each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
图9
各组茜素红染色观察（×40）
a. CPC 组；b. CUR-CPC 组；c. HA-CPC 组；d. HA/CUR-CPC 组
Figure9. Alizarin red staining observation of each group (×40)a. CPC group; b. CUR-CPC group; c. HA-CPC group; d. HA/CUR-CPC group
3 讨论
近年来对 CPC 改性成为国内外学者研究热点，尤其是利用中成药改性的研究。比如韩愈等[13]采用淫羊藿苷与 CPC 形成蛋白载体来修复骨缺损；董航等[14]研究了载骨碎补总黄酮 CPC 对骨缺损模型大鼠诱导膜成骨分化的影响，结果显示载骨碎补总黄酮 CPC 通过激活 BMP-2/Smad 通路，调节成骨细胞分化，促进骨缺损模型大鼠诱导膜的成骨作用。
大量临床研究证实 CUR 具有广泛的药理作用，但对成骨细胞的作用研究较少，主要是因为 CUR 水溶性差，如何对 CUR 改性成为了首要问题。目前已有学者对 CUR 进行了改性，如 Landeros 等[15]以第 2 代聚酯枝晶（树枝化）对 CUR 酚基团进行改性，以达到最佳的亲水/疏水平衡，使新的 CUR 衍生物能在室温下完全水溶，并表现出良好稳定性。本研究引入 HA 对 CUR 进行改性，使 CUR 基团的羟基键与 HA 的羧基键共酯化结合。傅里叶变换红外光谱仪检测显示 HA 已成功共价结合到 CUR 的分子骨架，而且 HA/CUR 完全溶于水，表现出良好的水溶性。
CUR 改性后，本研究将 HA/CUR 与 CPC 进行复合，制备了 HA/CUR-CPC。可注射性测试及凝结时间测试显示，HA/CUR-CPC 在上述两个方面与单纯 CPC 相比均无显著差异，为其临床用于 OVCF 奠定了基础。另外，生物力学测试显示，HA/CUR-CPC 压缩强度约为 20 MPa，与单纯 CPC 相比差异无统计学意义，提示添加 HA/CUR 未影响 CPC 骨水泥的力学性能，可满足人体椎体的机械应力要求[16]，不影响其临床应用。
在物理性能检测基础上，本研究进一步将 HA/CUR-CPC 与成骨细胞复合培养，观察其生物相容性以及对成骨细胞成骨能力的影响。复合培养 48 h 后，与其他骨水泥相比，成骨细胞能较好地黏附于 HA/CUR-CPC 材料表面生长，且有较多的细胞外基质生成，提示 CUR 对细胞无毒性作用，对细胞增殖还有促进作用[17]。OPN 蛋白作为早期成骨标志物，能准确地表达早期成骨活性，免疫荧光染色显示成骨细胞在 HA/CUR-CPC 材料表面能分泌 OPN 蛋白，且明显优于其余骨水泥。ALP 的表达是成骨细胞在早期体外分化成熟的重要标志，ALP 染色示 HA/CUR-CPC 组 ALP 表达较其他组更显著。茜素红染色主要用于鉴定成骨分化能力，HA/CUR-CPC 组深红色钙化结节明显多于其他组。上述检测结果均表明 CPC 中添加 HA/CUR 可明显促进成骨细胞的成骨分化活性，且不影响成骨细胞增殖。
综上述， 与单纯 CPC 相比，HA/CUR-CPC 能显著促进成骨细胞增殖及提高其成骨能力，并且力学强度无明显下降，符合临床应用要求。后续我们将对其体内应用及相关分子机制作进一步探索。
作者贡献：郝定均、贾帅军、朱雷负责实验设计；张鹰负责实验实施、数据收集整理及统计分析、撰写文章；田方、高新林、王致远负责数据收集整理及统计分析；朱雷参与文章撰写。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
机构伦理问题：研究方案经西安交通大学附属红会医院医学伦理委员会批准（202001010）。实验动物使用许可证号：SYXK（陕）2018-001。
