引用本文： 郑咏舰, 张凤玲, 邓呈亮, 魏在荣. 高糖微环境对脂肪来源干细胞生物学活性影响的研究进展. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(12): 1602-1606. doi: 10.7507/1002-1892.202003094 复制
脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是存在于脂肪组织中，具有自我复制和分化为多种细胞系能力的 MSCs。ADSCs 大多处于静止状态，在受到内部或外部刺激下，会重新进入细胞周期进行自我更新和分化[1]。ADSCs 具有很高的可塑性，具有向脂肪、软骨、成骨、成肌等多向分化潜能，同时分泌大量细胞因子，诱导活化细胞免疫抑制功能[2]，亦能归巢到损伤区域，参与局部组织重建[3]，修复慢性创面[4-5]、神经退行性疾病[6]和心血管并发症中受损的组织[7]。糖尿病患者创面与组织损伤具有难愈合、难修复的特点，与患者体内高糖微环境对细胞功能的影响有重要联系。但近期有文献报道，高糖微环境中 ADSCs 神经分化能力增强，这与既往 Tomlinson 等[8]报道的高糖微环境会引起神经元毒性的结论不一致。本文就高糖微环境对 ADSCs 一般特性、分化潜能、对血管及神经再生影响等方面的研究进展进行综述。
1 高糖微环境中 ADSCs 一般特性
1.1 细胞形态
有学者认为高糖微环境中 ADSCs 形态与正常 ADSCs（normal ADSCs，nADSCs）相似，细胞生长具有一定方向性，呈长梭形、鱼群状排列[9]，但随着培养时间延长，高糖微环境中 ADSCs 的生长速度明显低于 nADSCs，圆形及多角形细胞也出现得更早、更多。Chen 等[10]研究中 ADSCs 经糖基化诱导处理 6 d 后，细胞形态开始出现“煎蛋”样和多边形改变，数量随诱导时间延长而增加。Cheng 等[11]和 Stolzing 等[12]实验结果表明，相较于低糖培养基处理的 nADSCs，糖尿病 ADSCs（diabetes ADSCs，dADSCs）与经过高糖培养基处理的 nADSCs 形态出现明显变化，从纺锤形变为扁平形，细胞体积变大，细胞质面积变大。许言文等[13]认为这种形态学上的差异可能与糖尿病溃疡难以愈合有很大联系。
1.2 细胞增殖和迁移
研究显示，高糖微环境中的 ADSCs 表现出更低的细胞增殖与体外迁移能力，以及更高水平的细胞衰老和凋亡[11, 14-15]，促凋亡基因 Caspase-3 和 p53 的表达高于 nADSCs[16]，细胞凋亡基因活性明显增加；TNF 在细胞凋亡中也发挥重要作用，而在高糖培养基条件下 ADSCs 中 TNF-α 水平更高，TNF-α 可以进一步增强 Caspase 活性[17]；高浓度葡萄糖可通过 Akt /mTOR 信号通路诱导 MSCs 衰老[18]。Bufalo 等[19]以及 Alikhani 等[20]研究表明高糖微环境中晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end products，AGEs）持续累积，其通过结合特定的受体激活炎症和细胞内活性氧相关反应，导致细胞内一氧化氮合酶和神经酰胺增加，进而激活 p38 和 JNK，活化的 p38 和 JNK 又激活级联反应，从而导致 FoxO1 的激活，而 FoxO1 的激活导致 MAPK 信号传导通路诱导细胞凋亡。而 Davies 等[21]研究显示 dADSCs 增殖与迁移能力较 nADSCs 无明显改变；金鑫等[22]用盐藻糖酶糖基化处理人 ADSCs，发现细胞增殖能力无明显变化。
1.3 细胞表面标记物
目前尚未发现 ADSCs 的特异性细胞表面标记物，普遍采用相对特异的细胞表面标记物联合多向诱导分化进行细胞鉴定。而表面标记物的差异也与细胞的来源、提取、分离、培养及细胞代数有关。有研究显示，未分化的 dADSCs 和 nADSCs 其细胞表面标志物的表达与 MSCs 相似且具有特征性，CD13、CD44、CD73、CD90、CD105 表达呈阳性，CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR 表达呈阴性，且表达量相近[23-24]。Liu 等[25]报道高糖微环境中 ADSCs 的免疫表型发生变化，其中 dADSCs 细胞表面标志物 CD105 表达量升高，同时利用糖尿病血管基质成分上清液处理 nADSCs 后，细胞表型也产生了变化。与 nADSCs 相比，高糖微环境中的 ADSCs 获得了一种促炎免疫表型，CD40、CD80 表达量升高[26-27]。
2 细胞分化潜能
高糖微环境中的 ADSCs 与 nADSCs 均能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，其中 dADSCs 相比 nADSCs 具有较弱的成骨和成软骨分化能力，以及更强的成脂分化能力[16, 28]。Cramer 等[16]和 Keats 等[29]的研究表明，dADSCs 和高糖培养基处理后的 ADSCs 中，与成骨分化潜能相关的 ALP 活性均降低，导致成骨能力减弱；成软骨分化的谱系特异性基因 BMP-6、COL2A1、COL10A1 和 Sox6 的表达明显降低，导致成软骨能力减弱；而成脂能力增强，其成脂标志物（如过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 和脂蛋白脂肪酶）的表达上调[16, 30]。Zhang 等[31]认为成骨能力下降可能还与 AGEs 上调了糖基化 ADSCs 中的 DNA 甲基化水平相关。Li 等[32]研究显示高糖培养基与 AGEs 通过刺激硫氧环蛋白相互作用蛋白，对 MSCs 成骨能力产生负面影响。但是，杨卉馨等[33]及 García-Hernández 等[34]的研究结果提示高糖培养基增强了小鼠 ADSCs 成骨能力，可能与高糖培养基在成骨分化过程中激活骨钙素及 ALP 活性有关。也有学者认为相对于 nADSCs，dADSCs 成骨、成脂能力均较弱，因为 dADSCs 不能分化为成熟的功能性脂肪细胞[35]。有研究表明，高糖培养基会损害Ⅱ型胶原蛋白的合成和增加活性氧的活性，通过炎症介质介导软骨破坏，同时抑制了 ADSCs 的成软骨能力[36]。Tareck 等[37]与 Cheng 等[11]的研究结果表明，高糖微环境可引起细胞内活性氧水平升高，而低浓度的活性氧并不产生细胞毒性，并可使 dADSCs 与高糖培养基诱导培养后的 ADSCs 中巢蛋白和微管相关蛋白 2 两种神经源性分化标记蛋白表达增加，表现出更强的神经源细胞分化潜能。
3 促进血管再生能力
ADSCs 广泛分布于外周血管周围，具有分化为内皮细胞、平滑肌细胞等血管相关细胞的潜能，同时又能分泌大量血管再生相关细胞因子及生长因子，如 VEGF、PDGF、基质细胞衍生因子 1、肝细胞生长因子以及血管生成素 1、2 等，这些因子在血管发生及血管生成过程中都起到了重要作用。Rennert 等[38]和 Harris 等[39]研究表明高糖微环境中 ADSCs 分泌的 VEGF、FGF、PDGF、基质细胞衍生因子 1 等细胞因子及其相关受体表达量均降低，且促血管再生能力也较 nADSCs 减弱，这可能与高糖微环境选择性消耗相应功能的细胞亚群有关。同时，伍锋等[40]和王哲等[41]研究表明 AGEs 会抑制 ADSCs 分泌 VEGF、肝细胞生长因子 1 和 IGF-1 蛋白的能力，且呈浓度依赖效应，分析原因为 AGEs 能引起细胞内活性氧上调，增强氧化应激，破坏细胞内环境稳定性，从而影响 ADSCs 旁分泌功能。Gu 等[42]发现缺氧环境刺激 dADSCs 与 nADSCs 后，其分泌 VEGF、肝细胞生长因子能力均有所提升，但 nADSCs 促血管再生能力仍较强，可能因缺氧提高了缺氧诱导因子 1 的水平，从而增加了与抗凋亡和血管生成因子相关基因的表达。由于血管再生在促进创面愈合中起到关键性作用，大量研究显示高糖微环境会损伤 ADSCs 促血管再生与创面愈合的能力[43-44]。但 Lafosse 等[45]和 Policha 等[46]研究表明 dADSCs 与 nADSCs 在分泌 VEGF、增强内皮细胞分化与促进血管再生方面无明显差异。上述研究结果差异可能与细胞来源于不同年龄段糖尿病患者有关，也可能因 dADSCs 的促血管再生能力变化在体内无法准确检测所致[47]。
4 促神经再生能力
周围神经受损后近端回缩，远端轴突和髓鞘膨胀、分解成碎片，发生 Wallerian 变性。神经再生主要目的是使轴突恢复连续性。神经损伤后其近端残端和远端整个轴突中的雪旺细胞均分化为祖细胞样细胞，并迅速增殖，与巨噬细胞共同协调炎症反应，清除碎片并重塑局部微环境[48]。ADSCs 可以通过促进损伤神经周围新生血管再生，调节炎症反应及调节免疫来促进周围神经再生；同时 ADSCs 可分泌神经修复相关的 NGF、人脑源性神经因子、人神经营养因子 3，并且在自行或在特定情况下诱导分化成为雪旺细胞样细胞，参与轴突的髓鞘化[49-51]。大量研究表明，高糖微环境下胰岛素相关信号受损，多种葡萄糖毒性途径激活，包括多元醇旁路激活、蛋白质的非酶糖基化、己糖胺途径和蛋白激酶 C 活性改变，这些代谢途径的激活可能最终导致神经元和邻近微血管系统的氧化和炎症应激，引起周围神经性病变。高糖微环境下 AGEs 积累，引起 AGEs 受体上调，相互作用后引起 Sirt1、Nrf2 蛋白下调，导致促氧化剂和促炎信号通路的激活，引起神经退行性病变[8, 10, 52]。Chen 等[53]进一步研究表明上调 MSCs 中的 Nrf2 蛋白可促进雪旺细胞增殖、抑制细胞凋亡，对抗氧化应激和炎症反应，使损伤坐骨神经中血管与神经形成增加。在糖尿病早期，患者往往出现“痛觉敏感”时期，随着病程延长逐渐出现感觉减退，这可能与早期少量 AGEs 可引起低水平的炎症与氧化应激反应，从而造成神经相关营养因子与炎症因子分泌增多有关[54-55]；同时缺氧会刺激缺氧诱导因子 1 上调，促进 ADSCs 分泌 VEGF，诱导周围神经血管新生来恢复神经血流，并可能促进周围神经存活[56]。Cheng 等[11]发现 dADSCs 具有更强的神经源细胞分化潜能，其巢蛋白和微管相关蛋白 2 两种神经源性分化标记蛋白表达量增加。而 Xiao 等[57]通过小鼠创面局部移植 dADSCs 与 nADSCs 研究，发现 dADSCs 在促进小鼠创面神经再生能力方面与 nADSCs 相比无明显差异。
5 小结与展望
关于高糖微环境对 ADSCs 生物学活性及功能影响的研究结论尚不完全一致，但研究者普遍认为高糖微环境中 AGEs 积累后会通过多种途径导致 ADSCs 的生物学活性改变，包括细胞表面标记物、增殖、迁移、多谱系分化、分泌功能及组织修复能力等方面。所以，在移植受高糖微环境影响的 ADSCs 前，应充分考虑其细胞功能的改变。目前，高糖微环境中 ADSCs 促进周围神经及血管再生的能力存在争议，相关机制还需进一步研究。
作者贡献：郑咏舰负责综述构思及设计、文章撰写；张凤玲负责资料收集整理；魏在荣、邓呈亮负责观点形成及文章修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金经费支持没有影响文章观点。
脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells，ADSCs）是存在于脂肪组织中，具有自我复制和分化为多种细胞系能力的 MSCs。ADSCs 大多处于静止状态，在受到内部或外部刺激下，会重新进入细胞周期进行自我更新和分化[1]。ADSCs 具有很高的可塑性，具有向脂肪、软骨、成骨、成肌等多向分化潜能，同时分泌大量细胞因子，诱导活化细胞免疫抑制功能[2]，亦能归巢到损伤区域，参与局部组织重建[3]，修复慢性创面[4-5]、神经退行性疾病[6]和心血管并发症中受损的组织[7]。糖尿病患者创面与组织损伤具有难愈合、难修复的特点，与患者体内高糖微环境对细胞功能的影响有重要联系。但近期有文献报道，高糖微环境中 ADSCs 神经分化能力增强，这与既往 Tomlinson 等[8]报道的高糖微环境会引起神经元毒性的结论不一致。本文就高糖微环境对 ADSCs 一般特性、分化潜能、对血管及神经再生影响等方面的研究进展进行综述。
1 高糖微环境中 ADSCs 一般特性
1.1 细胞形态
有学者认为高糖微环境中 ADSCs 形态与正常 ADSCs（normal ADSCs，nADSCs）相似，细胞生长具有一定方向性，呈长梭形、鱼群状排列[9]，但随着培养时间延长，高糖微环境中 ADSCs 的生长速度明显低于 nADSCs，圆形及多角形细胞也出现得更早、更多。Chen 等[10]研究中 ADSCs 经糖基化诱导处理 6 d 后，细胞形态开始出现“煎蛋”样和多边形改变，数量随诱导时间延长而增加。Cheng 等[11]和 Stolzing 等[12]实验结果表明，相较于低糖培养基处理的 nADSCs，糖尿病 ADSCs（diabetes ADSCs，dADSCs）与经过高糖培养基处理的 nADSCs 形态出现明显变化，从纺锤形变为扁平形，细胞体积变大，细胞质面积变大。许言文等[13]认为这种形态学上的差异可能与糖尿病溃疡难以愈合有很大联系。
1.2 细胞增殖和迁移
研究显示，高糖微环境中的 ADSCs 表现出更低的细胞增殖与体外迁移能力，以及更高水平的细胞衰老和凋亡[11, 14-15]，促凋亡基因 Caspase-3 和 p53 的表达高于 nADSCs[16]，细胞凋亡基因活性明显增加；TNF 在细胞凋亡中也发挥重要作用，而在高糖培养基条件下 ADSCs 中 TNF-α 水平更高，TNF-α 可以进一步增强 Caspase 活性[17]；高浓度葡萄糖可通过 Akt /mTOR 信号通路诱导 MSCs 衰老[18]。Bufalo 等[19]以及 Alikhani 等[20]研究表明高糖微环境中晚期糖基化终末产物（advanced glycosylation end products，AGEs）持续累积，其通过结合特定的受体激活炎症和细胞内活性氧相关反应，导致细胞内一氧化氮合酶和神经酰胺增加，进而激活 p38 和 JNK，活化的 p38 和 JNK 又激活级联反应，从而导致 FoxO1 的激活，而 FoxO1 的激活导致 MAPK 信号传导通路诱导细胞凋亡。而 Davies 等[21]研究显示 dADSCs 增殖与迁移能力较 nADSCs 无明显改变；金鑫等[22]用盐藻糖酶糖基化处理人 ADSCs，发现细胞增殖能力无明显变化。
1.3 细胞表面标记物
目前尚未发现 ADSCs 的特异性细胞表面标记物，普遍采用相对特异的细胞表面标记物联合多向诱导分化进行细胞鉴定。而表面标记物的差异也与细胞的来源、提取、分离、培养及细胞代数有关。有研究显示，未分化的 dADSCs 和 nADSCs 其细胞表面标志物的表达与 MSCs 相似且具有特征性，CD13、CD44、CD73、CD90、CD105 表达呈阳性，CD45、CD34、CD11b、CD19、HLA-DR 表达呈阴性，且表达量相近[23-24]。Liu 等[25]报道高糖微环境中 ADSCs 的免疫表型发生变化，其中 dADSCs 细胞表面标志物 CD105 表达量升高，同时利用糖尿病血管基质成分上清液处理 nADSCs 后，细胞表型也产生了变化。与 nADSCs 相比，高糖微环境中的 ADSCs 获得了一种促炎免疫表型，CD40、CD80 表达量升高[26-27]。
2 细胞分化潜能
高糖微环境中的 ADSCs 与 nADSCs 均能分化为成骨细胞、软骨细胞、脂肪细胞，其中 dADSCs 相比 nADSCs 具有较弱的成骨和成软骨分化能力，以及更强的成脂分化能力[16, 28]。Cramer 等[16]和 Keats 等[29]的研究表明，dADSCs 和高糖培养基处理后的 ADSCs 中，与成骨分化潜能相关的 ALP 活性均降低，导致成骨能力减弱；成软骨分化的谱系特异性基因 BMP-6、COL2A1、COL10A1 和 Sox6 的表达明显降低，导致成软骨能力减弱；而成脂能力增强，其成脂标志物（如过氧化物酶体增殖物激活受体 γ 和脂蛋白脂肪酶）的表达上调[16, 30]。Zhang 等[31]认为成骨能力下降可能还与 AGEs 上调了糖基化 ADSCs 中的 DNA 甲基化水平相关。Li 等[32]研究显示高糖培养基与 AGEs 通过刺激硫氧环蛋白相互作用蛋白，对 MSCs 成骨能力产生负面影响。但是，杨卉馨等[33]及 García-Hernández 等[34]的研究结果提示高糖培养基增强了小鼠 ADSCs 成骨能力，可能与高糖培养基在成骨分化过程中激活骨钙素及 ALP 活性有关。也有学者认为相对于 nADSCs，dADSCs 成骨、成脂能力均较弱，因为 dADSCs 不能分化为成熟的功能性脂肪细胞[35]。有研究表明，高糖培养基会损害Ⅱ型胶原蛋白的合成和增加活性氧的活性，通过炎症介质介导软骨破坏，同时抑制了 ADSCs 的成软骨能力[36]。Tareck 等[37]与 Cheng 等[11]的研究结果表明，高糖微环境可引起细胞内活性氧水平升高，而低浓度的活性氧并不产生细胞毒性，并可使 dADSCs 与高糖培养基诱导培养后的 ADSCs 中巢蛋白和微管相关蛋白 2 两种神经源性分化标记蛋白表达增加，表现出更强的神经源细胞分化潜能。
3 促进血管再生能力
ADSCs 广泛分布于外周血管周围，具有分化为内皮细胞、平滑肌细胞等血管相关细胞的潜能，同时又能分泌大量血管再生相关细胞因子及生长因子，如 VEGF、PDGF、基质细胞衍生因子 1、肝细胞生长因子以及血管生成素 1、2 等，这些因子在血管发生及血管生成过程中都起到了重要作用。Rennert 等[38]和 Harris 等[39]研究表明高糖微环境中 ADSCs 分泌的 VEGF、FGF、PDGF、基质细胞衍生因子 1 等细胞因子及其相关受体表达量均降低，且促血管再生能力也较 nADSCs 减弱，这可能与高糖微环境选择性消耗相应功能的细胞亚群有关。同时，伍锋等[40]和王哲等[41]研究表明 AGEs 会抑制 ADSCs 分泌 VEGF、肝细胞生长因子 1 和 IGF-1 蛋白的能力，且呈浓度依赖效应，分析原因为 AGEs 能引起细胞内活性氧上调，增强氧化应激，破坏细胞内环境稳定性，从而影响 ADSCs 旁分泌功能。Gu 等[42]发现缺氧环境刺激 dADSCs 与 nADSCs 后，其分泌 VEGF、肝细胞生长因子能力均有所提升，但 nADSCs 促血管再生能力仍较强，可能因缺氧提高了缺氧诱导因子 1 的水平，从而增加了与抗凋亡和血管生成因子相关基因的表达。由于血管再生在促进创面愈合中起到关键性作用，大量研究显示高糖微环境会损伤 ADSCs 促血管再生与创面愈合的能力[43-44]。但 Lafosse 等[45]和 Policha 等[46]研究表明 dADSCs 与 nADSCs 在分泌 VEGF、增强内皮细胞分化与促进血管再生方面无明显差异。上述研究结果差异可能与细胞来源于不同年龄段糖尿病患者有关，也可能因 dADSCs 的促血管再生能力变化在体内无法准确检测所致[47]。
4 促神经再生能力
周围神经受损后近端回缩，远端轴突和髓鞘膨胀、分解成碎片，发生 Wallerian 变性。神经再生主要目的是使轴突恢复连续性。神经损伤后其近端残端和远端整个轴突中的雪旺细胞均分化为祖细胞样细胞，并迅速增殖，与巨噬细胞共同协调炎症反应，清除碎片并重塑局部微环境[48]。ADSCs 可以通过促进损伤神经周围新生血管再生，调节炎症反应及调节免疫来促进周围神经再生；同时 ADSCs 可分泌神经修复相关的 NGF、人脑源性神经因子、人神经营养因子 3，并且在自行或在特定情况下诱导分化成为雪旺细胞样细胞，参与轴突的髓鞘化[49-51]。大量研究表明，高糖微环境下胰岛素相关信号受损，多种葡萄糖毒性途径激活，包括多元醇旁路激活、蛋白质的非酶糖基化、己糖胺途径和蛋白激酶 C 活性改变，这些代谢途径的激活可能最终导致神经元和邻近微血管系统的氧化和炎症应激，引起周围神经性病变。高糖微环境下 AGEs 积累，引起 AGEs 受体上调，相互作用后引起 Sirt1、Nrf2 蛋白下调，导致促氧化剂和促炎信号通路的激活，引起神经退行性病变[8, 10, 52]。Chen 等[53]进一步研究表明上调 MSCs 中的 Nrf2 蛋白可促进雪旺细胞增殖、抑制细胞凋亡，对抗氧化应激和炎症反应，使损伤坐骨神经中血管与神经形成增加。在糖尿病早期，患者往往出现“痛觉敏感”时期，随着病程延长逐渐出现感觉减退，这可能与早期少量 AGEs 可引起低水平的炎症与氧化应激反应，从而造成神经相关营养因子与炎症因子分泌增多有关[54-55]；同时缺氧会刺激缺氧诱导因子 1 上调，促进 ADSCs 分泌 VEGF，诱导周围神经血管新生来恢复神经血流，并可能促进周围神经存活[56]。Cheng 等[11]发现 dADSCs 具有更强的神经源细胞分化潜能，其巢蛋白和微管相关蛋白 2 两种神经源性分化标记蛋白表达量增加。而 Xiao 等[57]通过小鼠创面局部移植 dADSCs 与 nADSCs 研究，发现 dADSCs 在促进小鼠创面神经再生能力方面与 nADSCs 相比无明显差异。
5 小结与展望
关于高糖微环境对 ADSCs 生物学活性及功能影响的研究结论尚不完全一致，但研究者普遍认为高糖微环境中 AGEs 积累后会通过多种途径导致 ADSCs 的生物学活性改变，包括细胞表面标记物、增殖、迁移、多谱系分化、分泌功能及组织修复能力等方面。所以，在移植受高糖微环境影响的 ADSCs 前，应充分考虑其细胞功能的改变。目前，高糖微环境中 ADSCs 促进周围神经及血管再生的能力存在争议，相关机制还需进一步研究。
作者贡献：郑咏舰负责综述构思及设计、文章撰写；张凤玲负责资料收集整理；魏在荣、邓呈亮负责观点形成及文章修改。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。基金经费支持没有影响文章观点。