引用本文： 葛子路, 周兵华, 郑小龙, 杨明宇, 吕晶同, 邓泓鄗, 唐康来, 陈万. 肩袖腱病环状 RNA 表达特征与内源竞争 RNA 调控网络构建的研究. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(5): 608-614. doi: 10.7507/1002-1892.201911094 复制
肩袖腱病是临床常见的引起肩关节疼痛的骨骼肌肉系统疾病[1]，但发病机制尚不明确，通常认为是肩关节外在因素、环境因素及内在因素综合作用导致[2-3]。尽管近年临床对于肩袖腱病的认识有所提高，手术方式也不断改良，但由于具体发生机制不明确，无法进行针对性治疗，造成保守治疗方式有限，且存在术后肩袖再断裂率较高的问题[4]。
环状 RNA（circular RNA，circRNA）通常是指一类具有共价闭合环状结构，且没有游离的 5’末端和 3’尾端的内源性非编码 RNA[5]。近年来，越来越多疾病相关的 circRNA 表达谱被报道，通过生物信息学分析发现了许多与疾病发生、发展及转归相关的特异 circRNA[6-7]。circRNA 通常通过吸附在 miRNA 形成内源竞争 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）机制[8]，以调控轴的方式参与疾病发生、发展[9-10]。
已有研究表明，部分长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）参与肌腱的修复愈合[11]。然而，目前尚无针对肩袖腱病发病过程中 circRNA 表达情况的研究，circRNA 的 ceRNA 机制在肩袖腱病发生转归中的作用也有待探究。本研究采用高通量测序对正常肩袖及肩袖腱病组织进行研究，寻找差异表达的 circRNA，并对其靶基因进行预测，建立 circRNA 的 ceRNA 网络，探索肩袖腱病发生的潜在分子机制，为临床有效治疗肩袖腱病提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 标本收集及选择标准
肩袖组织样本由 2018 年 6 月—2019 年 6 月于中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院骨科运动医学中心因冈上肌腱损伤行手术治疗的患者捐赠。排除合并高血压、糖尿病等全身综合性疾病患者，MRI 及关节镜检查提示肩袖断缘钙化者，局部存在感染者，以及其他不适合本研究条件患者。
本研究共纳入 10 例患者，获得正常及肩袖腱病组织各 5 个。其中男 2 例，女 8 例；年龄 44～71 岁，平均 55.4 岁。体质量指数 18.6～27.0 kg/m2，平均 23.6 kg/m2。病程 1～24 个月，平均 8.2 个月。Bonar 评分 1～10 分，平均 5.4 分。有肩关节外伤史 5 例。术中关节镜下行冈上肌腱断缘新鲜化时，用刨刀清除肩袖边缘增生滑膜组织后，用篮钳夹取两块 2 mm×2 mm 大小的肩袖组织，1 块置于液氮中冷冻保存用于高通量测序，1 块置于 4% 甲醛固定用于组织学观察（HE、阿尔新蓝染色）。通过 MRI、关节镜检查以及组织学观察，确定肩袖为正常或腱病组织，再依据患者年龄、体质量以及 Bonar 评分[12]进行配伍分组。
1.2 主要试剂与仪器
RNeasy Mini Kit 试剂盒（Qiagen 公司，德国）；VAHTS Total RNA-seq（H/M/R）（南京诺唯赞生物科技有限公司）。光学显微镜（Olympus 公司，日本）；Agilent2100 生物分析仪、IIIumina HiSeqTM2500 测序系统（Agilent Technologies 公司，美国）；Qubit®3.0 荧光计（Life Technologies 公司，美国）；NanoDrop One 分光光度计（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）。
1.3 实验方法
1.3.1 测序文库构建
① 总 RNA 提取及检测：将肩袖组织剪碎后，按照 RNeasy Mini Kit 试剂盒说明书提取总 RNA，Agilent2100 生物分析仪进行质量检测、Qubit®3.0 荧光计和 NanoDrop One 分光光度计对总 RNA 进行纯度定量，评估 RNA 完整度后用于测序建库。
② circRNA 建库及测序：所有测序均按照南京诺唯赞生物科技有限公司提供的标准步骤执行。将 RNA 样本与探针杂交，用 RNase H 和 DNaseⅠ酶分别消化 DNA-RNA 杂链中的 RNA 和单双链的 DNA，纯化后回收剩余 RNA。依次完成第 1 链 cDNA 合成、第 2 链合成和末端修复、3’端加碱基腺嘌呤和接头连接以及尿嘧啶降解。最后进行 PCR 扩增建库和测序分析。此部分委托上海鲸舟基因科技有限公司完成。
1.3.2 差异 circRNA 筛选
依据肩袖腱病与正常肩袖组织 circRNA 差异表达倍数（fold change，FC），将筛选标准定为 P<0.05、|log2FC|>2。使用 SPSS22.0 统计软件采用独立样本 t 检验进行数据分析，筛选差异 circRNA；对表达上调及下调的差异 circRNA 进一步以 |log2FC| 降序排列。
1.3.3 生物信息学分析
对差异表达的 circRNA 亲本基因进行基因本体（gene ontology，GO）分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。GO 分析主要包括生物学过程、细胞组分和分子功能 3 组分类，基于 GO 数据库进行显著性分析。KEGG 通路分析是依据 KEGG 数据库对差异的亲本基因进行通路显著性分析。
circRNA 可以通过与 miRNA 的海绵吸附作用发挥调控功能。基于此，通过预测 miRNA 构建 ceRNA 网络，探究潜在的核心 ceRNA。应用 TargetScan 和 miRanda 对差异表达 circRNA 进行 circRNA-miRNA 关系预测，用 Cytoscape 可视化构建 circRNA-miRNA-mRNA 作用网络（ceRNA）。
2 结果
2.1 差异表达的 circRNA 聚类结果分析
肩袖腱病和正常肩袖组织中共检测到 10 990 条 circRNA，其中差异表达 circRNA 94 条。肩袖腱病组织中共 31 条表达上调、63 条表达下调，表达上调的 circRNA 中，log2 FC 最高为 circRNA.3431；表达下调的 circRNA 中，log2 FC 最高为 circRNA.4724。进一步以 log2 FC 绝对值降序排列，上调及下调前 5 位的 circRNA 见表1 及图1、2。
表1
正常肩袖及肩袖腱病组织表达差异排名前 5 位的 circRNA
Table1.
The top five significantly up- and down-regulated circRNAs in rotator cuff tendinopathy
图1
正常肩袖及肩袖腱病组织差异表达 circRNA 热图
红色表示上调，绿色表示下调 1～5：肩袖腱病样本 6～10：正常肩袖样本
Figure1. Cluster analysis of differentially expressed circRNAs in rotator cuff tendinopathy and normal tendonThe red for the up-regulated and the green for down-regulated differentially expressed circRNAs 1-5: Rotator cuff tendinopathy 6-10: Normal tendon
图2
正常肩袖及肩袖腱病组织差异表达 circRNA 火山图
Figure2.
Volcano plots of differentially expressed circRNAs in rotator cuff tendinopathy and normal tendon
2.2 GO 和 KEGG 分析
通过对 circRNA 的亲本基因进行 GO 富集分析发现，与肩袖腱病相关的基因最显著富集于环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）应答。通过 KEGG 通路分析发现，基因主要富集于细胞基质-受体交互、蛋白消化与吸收、细胞循环、B 细胞受体信号通路、FoxO 信号通路、NF-κB 信号通路和 T 细胞受体信号通路等。见图3。
图3
差异基因 GO 和 KEGG 分析
a. GO 富集；b. KEGG 富集
Figure3. GO and KEGG analysis of differentially expressed parental genesa. GO enrichment; b. KEGG enrichment
2.3 ceRNA 网络分析
在构建的 ceRNA 网络中（图4），共有 28 个 circRNA、13 个 miRNA、46 个 mRNA，其中交联最多的 circRNA、miRNA 以及 mRNA 分别是 circRNA.8442、has-miR-6089、GOLGA3。自由能最高的 ceRNA 调控轴为 circRNA.8951-has-miR-6089-DNMT3B。上述结果提示这些核心编码与非编码 RNA 可能在肩袖腱病发生过程中起着重要作用。
图4
circRNA‐miRNA‐mRNA (ceRNA) 调节网络
黄色线条表示上调，蓝色线条表示下调
Figure4. circRNA‐miRNA‐mRNA (ceRNA) regulatory networkYellow line for upregulation and blue line for downregulation
3 讨论
目前，对于肩袖腱病发病机制尚不清楚，可能与外在因素、内在因素均有关。其中外在因素包括肩袖过度使用、过度载荷以及与肩峰反复摩擦。但有组织学研究表明，肩袖腱病及断裂通常发生于关节腔侧而非滑囊侧[13]。一项多中心研究发现，肩袖腱病患者经肩峰下减压术治疗后，疗效无显著改善[14]。上述研究结果提示，包括肩峰外撞击理论在内的外在因素可能不是肩袖腱病发生发展的重要机制，内在因素可能更关键。因此，我们期望通过高通量测序和生物信息学分析，发现疾病发展过程中相对完整的小分子表达情况及其可能的相互作用关系，从而探究肩袖腱病潜在发病机制。
除了肩袖腱病的编码 RNA 表达谱[15]，非编码 RNA，如 lncRNA 和 miRNA 在肌腱病中的表达谱已有研究报道。Plachel 等[16]对退变肩袖 miRNA 表达谱分析，发现了 187 条差异表达的 miRNA，提示其中一些差异表达的 miRNA 可以作为疾病诊断以及预后判断的标志物。Zhang 等[17]通过对 23 对不同部位肌腱病组织标本进行 lncRNA 表达谱分析，发现了 40 条差异表达的 lncRNA。以上研究提示非编码 RNA 在肌腱病发生过程中可能发挥重要作用。circRNA 是一类新的具有调控功能的非编码 RNA，我们希望通过分析肩袖腱病 circRNA 表达谱，为非编码 RNA 在肌腱病发生中的作用提供补充，同时也为相关疾病的诊治提供新思路。
本研究通过对 circRNA 的亲本基因进行 GO 富集分析，发现与肩袖腱病相关的基因最显著富集于 cAMP 应答。cAMP 作为细胞内的“第 2 信使”，通过调节下游靶分子广泛参与细胞内物质代谢和生物功能调节[18]。Tucci 等[19]在一项针对手屈肌腱研究中发现，cAMP 表达增加抑制了肌腱对炎症的免疫应答。在另一项关于骨骼肌的研究中，研究者们发现 cAMP 应答与骨骼肌的脂肪化相关[20]。而肌腱的成脂变化是肩袖腱病组织学特征之一，提示相关富集的 circRNA 可能在肌腱成脂机制中扮演了重要角色。
通过 KEGG 通路分析发现，基因主要富集于细胞基质-受体交互、蛋白消化与吸收、细胞循环、B 细胞信号通路、FoxO 信号通路、NF-κB 信号通路和 T 细胞信号通路等。关于 NF-κB 信号通路在肌腱病中的作用值得探讨。NF-κB 信号通路主要包括了细胞质内一系列快反应蛋白家族复合体和这些蛋白的特异性二聚体抑制剂[21]。已有临床研究证明，NF-κB 信号通路与肌腱病术后疼痛症状相关[22]。Abraham 等[23]的研究证实人和鼠的肩袖腱病组织中，NF-κB 信号通路表达增高，IKKβ 是这一通路里重要的支点，当过表达 IKKβ 时，鼠的肩袖纤维化程度加重，而抑制 IKKβ 后肩袖腱病损伤愈合加速。这一研究也进一步证实了 NF-κB 信号通路在肩袖腱病发生发展中的重要作用。此外，FoxO 信号通路在肌腱细胞相关的压力应答中的表达变化也有文献报道[24]。这些富集在相关通路中差异表达的 circRNA，为进一步阐述这些通路机制在肩袖腱病发病中的作用提供了一些新思路。尽管目前尚无关于肌腱和肌腱病的相关 ceRNA 作用研究，但部分 circRNA 在肌肉疾病发生发展中的作用已有报道。circLMO7 能通过吸附 miR-378a-3p 来调节成肌细胞的分化以及增殖[25]。另外，其他非编码 RNA，如 lncRNA 在肌腱疾病的海绵吸附作用也有报道。lncH19 可以通过吸附 miR-29b-3p 来介导 TGF-β1 信号通路，从而加速肌腱分化以及愈合[26]。我们通过构建 circRNA 的 ceRNA 网络，发现了几个核心的 RNA 与相应的 ceRNA 调控轴。而自由能最高的 ceRNA 调控轴 circRNA.8951-has-miR-6089-DNMT3B 可能在肩袖腱病发生机制中扮演重要作用，但这一结果有待进一步验证。
此外，炎症在肩袖腱病的发生发展中扮演的角色一直没有得到有效探究。肩袖腱病组织学研究表明，腱病组织胶原纤维厚薄不均、排列无序紊乱，周围基质玻璃样变形，纤维间脂肪细胞沉积，而经典的炎症细胞缺乏光镜下征象[27]。因此，传统观点认为炎症和肩袖腱病发生无必然联系。然而，随着研究进展，这一观点受到质疑。Dakin 等[28]研究发现跟腱腱病组织中存在大量 CD14+、CD68+细胞以及大量炎症相关通路，如 NF-κB、干扰素、STAT-6 等。本研究中同样发现了大量炎症相关通路。通过 circRNA 的亲本基因 KEGG 分析，发现基因富集于 NF-κB、T 细胞受体信号通路、B 细胞受体信号通路等相关的炎症通路。这些结果提示炎症可能在肩袖腱病发生发展中起着重要作用。而 circRNA 在相关疾病炎症发生发展中的作用已有大量报道[29-30]。基于此，肩袖腱病中这些差异表达的 circRNA，可能在肩袖腱病炎症发生发展过程中扮演着重要角色。
但是本研究仍存在许多不足。首先，由于伦理原因，无法获得完全正常的对照标本。尽管所取标本经过组织学观察验证是相对正常标本，但由于来源于冈上肌腱损伤患者，故标本存在一定退变或病理性改变，这可能对最终测序结果造成一定影响。其次，尽管样本依据患者年龄、体质量以及 Bonar 评分进行配伍，但仍然存在个体差异。最后，通过生物信息学分析获得的 ceRNA 机制及其他相关差异基因，有待进一步在转录及蛋白水平验证。
作者贡献：葛子路负责撰写文章初稿及数据分析；周兵华、郑小龙、杨明宇负责患者招募及标本采集；吕晶同、邓泓鄗负责组织学染色；唐康来、陈万负责课题设计、实验及文章审核。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究及文章撰写过程中不存在任何利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和研究数据的统计分析。
机构伦理问题：研究方案经中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院医学伦理委员会批准（KY201838）。患者均签署知情同意书。
肩袖腱病是临床常见的引起肩关节疼痛的骨骼肌肉系统疾病[1]，但发病机制尚不明确，通常认为是肩关节外在因素、环境因素及内在因素综合作用导致[2-3]。尽管近年临床对于肩袖腱病的认识有所提高，手术方式也不断改良，但由于具体发生机制不明确，无法进行针对性治疗，造成保守治疗方式有限，且存在术后肩袖再断裂率较高的问题[4]。
环状 RNA（circular RNA，circRNA）通常是指一类具有共价闭合环状结构，且没有游离的 5’末端和 3’尾端的内源性非编码 RNA[5]。近年来，越来越多疾病相关的 circRNA 表达谱被报道，通过生物信息学分析发现了许多与疾病发生、发展及转归相关的特异 circRNA[6-7]。circRNA 通常通过吸附在 miRNA 形成内源竞争 RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）机制[8]，以调控轴的方式参与疾病发生、发展[9-10]。
已有研究表明，部分长链非编码 RNA（long non-coding RNA，lncRNA）参与肌腱的修复愈合[11]。然而，目前尚无针对肩袖腱病发病过程中 circRNA 表达情况的研究，circRNA 的 ceRNA 机制在肩袖腱病发生转归中的作用也有待探究。本研究采用高通量测序对正常肩袖及肩袖腱病组织进行研究，寻找差异表达的 circRNA，并对其靶基因进行预测，建立 circRNA 的 ceRNA 网络，探索肩袖腱病发生的潜在分子机制，为临床有效治疗肩袖腱病提供新的思路。
1 材料与方法
1.1 标本收集及选择标准
肩袖组织样本由 2018 年 6 月—2019 年 6 月于中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院骨科运动医学中心因冈上肌腱损伤行手术治疗的患者捐赠。排除合并高血压、糖尿病等全身综合性疾病患者，MRI 及关节镜检查提示肩袖断缘钙化者，局部存在感染者，以及其他不适合本研究条件患者。
本研究共纳入 10 例患者，获得正常及肩袖腱病组织各 5 个。其中男 2 例，女 8 例；年龄 44～71 岁，平均 55.4 岁。体质量指数 18.6～27.0 kg/m2，平均 23.6 kg/m2。病程 1～24 个月，平均 8.2 个月。Bonar 评分 1～10 分，平均 5.4 分。有肩关节外伤史 5 例。术中关节镜下行冈上肌腱断缘新鲜化时，用刨刀清除肩袖边缘增生滑膜组织后，用篮钳夹取两块 2 mm×2 mm 大小的肩袖组织，1 块置于液氮中冷冻保存用于高通量测序，1 块置于 4% 甲醛固定用于组织学观察（HE、阿尔新蓝染色）。通过 MRI、关节镜检查以及组织学观察，确定肩袖为正常或腱病组织，再依据患者年龄、体质量以及 Bonar 评分[12]进行配伍分组。
1.2 主要试剂与仪器
RNeasy Mini Kit 试剂盒（Qiagen 公司，德国）；VAHTS Total RNA-seq（H/M/R）（南京诺唯赞生物科技有限公司）。光学显微镜（Olympus 公司，日本）；Agilent2100 生物分析仪、IIIumina HiSeqTM2500 测序系统（Agilent Technologies 公司，美国）；Qubit®3.0 荧光计（Life Technologies 公司，美国）；NanoDrop One 分光光度计（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）。
1.3 实验方法
1.3.1 测序文库构建
① 总 RNA 提取及检测：将肩袖组织剪碎后，按照 RNeasy Mini Kit 试剂盒说明书提取总 RNA，Agilent2100 生物分析仪进行质量检测、Qubit®3.0 荧光计和 NanoDrop One 分光光度计对总 RNA 进行纯度定量，评估 RNA 完整度后用于测序建库。
② circRNA 建库及测序：所有测序均按照南京诺唯赞生物科技有限公司提供的标准步骤执行。将 RNA 样本与探针杂交，用 RNase H 和 DNaseⅠ酶分别消化 DNA-RNA 杂链中的 RNA 和单双链的 DNA，纯化后回收剩余 RNA。依次完成第 1 链 cDNA 合成、第 2 链合成和末端修复、3’端加碱基腺嘌呤和接头连接以及尿嘧啶降解。最后进行 PCR 扩增建库和测序分析。此部分委托上海鲸舟基因科技有限公司完成。
1.3.2 差异 circRNA 筛选
依据肩袖腱病与正常肩袖组织 circRNA 差异表达倍数（fold change，FC），将筛选标准定为 P<0.05、|log2FC|>2。使用 SPSS22.0 统计软件采用独立样本 t 检验进行数据分析，筛选差异 circRNA；对表达上调及下调的差异 circRNA 进一步以 |log2FC| 降序排列。
1.3.3 生物信息学分析
对差异表达的 circRNA 亲本基因进行基因本体（gene ontology，GO）分析及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析。GO 分析主要包括生物学过程、细胞组分和分子功能 3 组分类，基于 GO 数据库进行显著性分析。KEGG 通路分析是依据 KEGG 数据库对差异的亲本基因进行通路显著性分析。
circRNA 可以通过与 miRNA 的海绵吸附作用发挥调控功能。基于此，通过预测 miRNA 构建 ceRNA 网络，探究潜在的核心 ceRNA。应用 TargetScan 和 miRanda 对差异表达 circRNA 进行 circRNA-miRNA 关系预测，用 Cytoscape 可视化构建 circRNA-miRNA-mRNA 作用网络（ceRNA）。
2 结果
2.1 差异表达的 circRNA 聚类结果分析
肩袖腱病和正常肩袖组织中共检测到 10 990 条 circRNA，其中差异表达 circRNA 94 条。肩袖腱病组织中共 31 条表达上调、63 条表达下调，表达上调的 circRNA 中，log2 FC 最高为 circRNA.3431；表达下调的 circRNA 中，log2 FC 最高为 circRNA.4724。进一步以 log2 FC 绝对值降序排列，上调及下调前 5 位的 circRNA 见表1 及图1、2。
表1
正常肩袖及肩袖腱病组织表达差异排名前 5 位的 circRNA
Table1.
The top five significantly up- and down-regulated circRNAs in rotator cuff tendinopathy
图1
正常肩袖及肩袖腱病组织差异表达 circRNA 热图
红色表示上调，绿色表示下调 1～5：肩袖腱病样本 6～10：正常肩袖样本
Figure1. Cluster analysis of differentially expressed circRNAs in rotator cuff tendinopathy and normal tendonThe red for the up-regulated and the green for down-regulated differentially expressed circRNAs 1-5: Rotator cuff tendinopathy 6-10: Normal tendon
图2
正常肩袖及肩袖腱病组织差异表达 circRNA 火山图
Figure2.
Volcano plots of differentially expressed circRNAs in rotator cuff tendinopathy and normal tendon
2.2 GO 和 KEGG 分析
通过对 circRNA 的亲本基因进行 GO 富集分析发现，与肩袖腱病相关的基因最显著富集于环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）应答。通过 KEGG 通路分析发现，基因主要富集于细胞基质-受体交互、蛋白消化与吸收、细胞循环、B 细胞受体信号通路、FoxO 信号通路、NF-κB 信号通路和 T 细胞受体信号通路等。见图3。
图3
差异基因 GO 和 KEGG 分析
a. GO 富集；b. KEGG 富集
Figure3. GO and KEGG analysis of differentially expressed parental genesa. GO enrichment; b. KEGG enrichment
2.3 ceRNA 网络分析
在构建的 ceRNA 网络中（图4），共有 28 个 circRNA、13 个 miRNA、46 个 mRNA，其中交联最多的 circRNA、miRNA 以及 mRNA 分别是 circRNA.8442、has-miR-6089、GOLGA3。自由能最高的 ceRNA 调控轴为 circRNA.8951-has-miR-6089-DNMT3B。上述结果提示这些核心编码与非编码 RNA 可能在肩袖腱病发生过程中起着重要作用。
图4
circRNA‐miRNA‐mRNA (ceRNA) 调节网络
黄色线条表示上调，蓝色线条表示下调
Figure4. circRNA‐miRNA‐mRNA (ceRNA) regulatory networkYellow line for upregulation and blue line for downregulation
3 讨论
目前，对于肩袖腱病发病机制尚不清楚，可能与外在因素、内在因素均有关。其中外在因素包括肩袖过度使用、过度载荷以及与肩峰反复摩擦。但有组织学研究表明，肩袖腱病及断裂通常发生于关节腔侧而非滑囊侧[13]。一项多中心研究发现，肩袖腱病患者经肩峰下减压术治疗后，疗效无显著改善[14]。上述研究结果提示，包括肩峰外撞击理论在内的外在因素可能不是肩袖腱病发生发展的重要机制，内在因素可能更关键。因此，我们期望通过高通量测序和生物信息学分析，发现疾病发展过程中相对完整的小分子表达情况及其可能的相互作用关系，从而探究肩袖腱病潜在发病机制。
除了肩袖腱病的编码 RNA 表达谱[15]，非编码 RNA，如 lncRNA 和 miRNA 在肌腱病中的表达谱已有研究报道。Plachel 等[16]对退变肩袖 miRNA 表达谱分析，发现了 187 条差异表达的 miRNA，提示其中一些差异表达的 miRNA 可以作为疾病诊断以及预后判断的标志物。Zhang 等[17]通过对 23 对不同部位肌腱病组织标本进行 lncRNA 表达谱分析，发现了 40 条差异表达的 lncRNA。以上研究提示非编码 RNA 在肌腱病发生过程中可能发挥重要作用。circRNA 是一类新的具有调控功能的非编码 RNA，我们希望通过分析肩袖腱病 circRNA 表达谱，为非编码 RNA 在肌腱病发生中的作用提供补充，同时也为相关疾病的诊治提供新思路。
本研究通过对 circRNA 的亲本基因进行 GO 富集分析，发现与肩袖腱病相关的基因最显著富集于 cAMP 应答。cAMP 作为细胞内的“第 2 信使”，通过调节下游靶分子广泛参与细胞内物质代谢和生物功能调节[18]。Tucci 等[19]在一项针对手屈肌腱研究中发现，cAMP 表达增加抑制了肌腱对炎症的免疫应答。在另一项关于骨骼肌的研究中，研究者们发现 cAMP 应答与骨骼肌的脂肪化相关[20]。而肌腱的成脂变化是肩袖腱病组织学特征之一，提示相关富集的 circRNA 可能在肌腱成脂机制中扮演了重要角色。
通过 KEGG 通路分析发现，基因主要富集于细胞基质-受体交互、蛋白消化与吸收、细胞循环、B 细胞信号通路、FoxO 信号通路、NF-κB 信号通路和 T 细胞信号通路等。关于 NF-κB 信号通路在肌腱病中的作用值得探讨。NF-κB 信号通路主要包括了细胞质内一系列快反应蛋白家族复合体和这些蛋白的特异性二聚体抑制剂[21]。已有临床研究证明，NF-κB 信号通路与肌腱病术后疼痛症状相关[22]。Abraham 等[23]的研究证实人和鼠的肩袖腱病组织中，NF-κB 信号通路表达增高，IKKβ 是这一通路里重要的支点，当过表达 IKKβ 时，鼠的肩袖纤维化程度加重，而抑制 IKKβ 后肩袖腱病损伤愈合加速。这一研究也进一步证实了 NF-κB 信号通路在肩袖腱病发生发展中的重要作用。此外，FoxO 信号通路在肌腱细胞相关的压力应答中的表达变化也有文献报道[24]。这些富集在相关通路中差异表达的 circRNA，为进一步阐述这些通路机制在肩袖腱病发病中的作用提供了一些新思路。尽管目前尚无关于肌腱和肌腱病的相关 ceRNA 作用研究，但部分 circRNA 在肌肉疾病发生发展中的作用已有报道。circLMO7 能通过吸附 miR-378a-3p 来调节成肌细胞的分化以及增殖[25]。另外，其他非编码 RNA，如 lncRNA 在肌腱疾病的海绵吸附作用也有报道。lncH19 可以通过吸附 miR-29b-3p 来介导 TGF-β1 信号通路，从而加速肌腱分化以及愈合[26]。我们通过构建 circRNA 的 ceRNA 网络，发现了几个核心的 RNA 与相应的 ceRNA 调控轴。而自由能最高的 ceRNA 调控轴 circRNA.8951-has-miR-6089-DNMT3B 可能在肩袖腱病发生机制中扮演重要作用，但这一结果有待进一步验证。
此外，炎症在肩袖腱病的发生发展中扮演的角色一直没有得到有效探究。肩袖腱病组织学研究表明，腱病组织胶原纤维厚薄不均、排列无序紊乱，周围基质玻璃样变形，纤维间脂肪细胞沉积，而经典的炎症细胞缺乏光镜下征象[27]。因此，传统观点认为炎症和肩袖腱病发生无必然联系。然而，随着研究进展，这一观点受到质疑。Dakin 等[28]研究发现跟腱腱病组织中存在大量 CD14+、CD68+细胞以及大量炎症相关通路，如 NF-κB、干扰素、STAT-6 等。本研究中同样发现了大量炎症相关通路。通过 circRNA 的亲本基因 KEGG 分析，发现基因富集于 NF-κB、T 细胞受体信号通路、B 细胞受体信号通路等相关的炎症通路。这些结果提示炎症可能在肩袖腱病发生发展中起着重要作用。而 circRNA 在相关疾病炎症发生发展中的作用已有大量报道[29-30]。基于此，肩袖腱病中这些差异表达的 circRNA，可能在肩袖腱病炎症发生发展过程中扮演着重要角色。
但是本研究仍存在许多不足。首先，由于伦理原因，无法获得完全正常的对照标本。尽管所取标本经过组织学观察验证是相对正常标本，但由于来源于冈上肌腱损伤患者，故标本存在一定退变或病理性改变，这可能对最终测序结果造成一定影响。其次，尽管样本依据患者年龄、体质量以及 Bonar 评分进行配伍，但仍然存在个体差异。最后，通过生物信息学分析获得的 ceRNA 机制及其他相关差异基因，有待进一步在转录及蛋白水平验证。
作者贡献：葛子路负责撰写文章初稿及数据分析；周兵华、郑小龙、杨明宇负责患者招募及标本采集；吕晶同、邓泓鄗负责组织学染色；唐康来、陈万负责课题设计、实验及文章审核。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究及文章撰写过程中不存在任何利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和研究数据的统计分析。
机构伦理问题：研究方案经中国人民解放军陆军军医大学第一附属医院医学伦理委员会批准（KY201838）。患者均签署知情同意书。
