引用本文： 黄振明, 蔡卓, 钱静, 汪建雄, 胡宁. 微小 RNA-335-5p 调控 BMP-2 对人 BMSCs 成骨分化的影响. 中国修复重建外科杂志, 2020, 34(6): 781-786. doi: 10.7507/1002-1892.201910097 复制
人 BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）是人骨髓基质中的一种具有多向分化潜能的细胞亚群[1]，在特定条件诱导下可分化为成肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等细胞系[2]。hBMSCs 的成骨分化与骨质疏松症的发生发展密切相关[3]，且在骨组织工程中发挥重要作用[4]。因此探讨 BMSCs 的成骨分化机制，提高其分化能力，具有重要意义。微小 RNA（micro RNA，miR）-335-5p 是一种进化上高度保守的非编码单链小分子 RNA，可介导 MSCs 的成骨、成脂及成软骨分化[5]，在成骨细胞中高表达，可通过下调 Wnt 拮抗剂 DKK1 的表达促进成骨细胞增殖和分化，增强骨形成及骨再生[6-7]。BMP-2 属于 TGF-β 超家族，具有促进成骨细胞生长和分化的作用[8]，能增强骨细胞外基质合成，并可促进 MSCs 成骨分化，广泛用于骨组织工程研究，对临床骨组织缺损、软骨损伤、骨再生等的疗效确切[9-10]。但 miR-335-5p 是否可通过调控 BMP-2 促进 hBMSCs 成骨分化，目前还不清楚。本研究通过过表达或抑制体外培养的 hBMSCs 细胞系中 miR-335-5p 表达，对 miR-335-5p 通过调控 BMP-2 对 hBMSCs 成骨分化的影响进行研究。
1 材料与方法
1.1 实验细胞、试剂及仪器
hBMSCs（上海中乔新舟生物科技有限公司）；miR-335-5p mimics（模拟物）、miR-335-5p mimics 阴性对照、miR-335-5p inhibitor（抑制剂）、miR-335-5p inhibitor 阴性对照（上海吉玛基因有限公司）；H-DMEM 培养基（上海微科生物技术有限公司）；FBS、PBS 缓冲液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）；Opti-MEM 减血清培养基、LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美国）；ALP 染色试剂盒（上海士锋生物科技有限公司）；茜素红染色液（上海联硕生物科技有限公司）；RNAiso Plus、逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒（Takara 公司，日本）；兔源 BMP-2、Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙素（osteocalcin，OCN）及 GAPDH 一抗、羊抗兔二抗（Abcam 公司，美国）；蛋白提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；BCA 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。
CKX41-F32F 光学显微镜（Olympus 公司，日本）；3900 型高通量 DNA 合成仪（美国应用生物系统公司）；Centrifuge 5424R 低温高速离心机（Eppendorf 公司，德国）；CFX96 Touch Deep Well qRT-PCR 仪、1659001 蛋白电泳仪、Trans-Blot Turbo 转膜仪（Bio-Rad 公司，美国）；IBright CL 1500 凝胶成像系统（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；恒温水浴锅（上海析达仪器有限公司）；XB-70 制冰机（GRANT 公司，美国）。
1.2 细胞培养
将冻存的 hBMSCs 细胞株置于 39 ℃ 水浴中快速冻融，然后离心（1 000×g，5 min）；取细胞沉淀，加入完全培养基（500 mL H-DMEM 培养基中含 10%FBS、100 U/mL 青链霉素混合液）重悬，接种至 25 cm2培养瓶中，放入 37 ℃、5%CO2 培养箱中培养。当细胞生长至融合率 85% 左右时，胰蛋白酶-EDTA 消化后以完全培养基重悬，按 1∶3 比例传代培养。
1.3 实验分组及方法
待第 2 代 hBMSCs 融合率达 85% 左右时，以胰蛋白酶-EDTA 消化后重悬，吹打均匀后计数，以 5×105个/mL 密度接种于 4 个 24 孔板中，培养 24 h 后，每板细胞随机分为对照组（A 组）、miR-335-5p mimics 组（B 组）、miR-335-5p mimics 阴性对照组（C 组）、miR-335-5p inhibitor 组（D 组）、miR-335-5p inhibitor 阴性对照组（E 组），每组设 3 个复孔。参照说明书步骤，以 50 μL Opti-MEM 减血清培养基溶解 1 μL LipofectamineTM2000 混匀，同时分别以 50 μL Opti-MEM 减血清培养基溶解 miR-335-5p mimics、miR-335-5p mimics 阴性对照、miR-335-5p inhibitor、miR-335-5p inhibitor 阴性对照（浓度参照说明书）混匀，均静置 20 min。将 LipofectamineTM2000 溶液分别与 miR-335-5p mimics、miR-335-5p mimics 阴性对照、miR-335-5p inhibitor、miR-335-5p inhibitor 阴性对照溶液混匀，分别处理各组细胞，并将培养基更换成 Opti-MEM 减血清培养基培养。6 h 后再换为成骨诱导分化培养基（500 mL 完全培养基中含 10 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 维生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油钠）[11]继续培养 1 周后，收集细胞进行以下观测。其中 2 个 24 孔板中的各组细胞收集后分别用于 qRT-PCR 及 Western blot 检测；另 2 个 24 孔板中的各组细胞去除培养基后以 PBS 漂洗干净，然后加入 4% 多聚甲醛固定 2 h，用于 ALP 及茜素红染色观察。
1.4 观测指标
1.4.1 ALP 染色观察
取 1 个 24 孔板，采用 ALP 染色试剂盒对各组细胞进行染色，光镜下观察，呈紫色的为 ALP 阳性细胞。随机选择 5 个视野拍照，并按以下公式计算各组 ALP 阳性细胞相对比例：实验组阳性细胞数/对照组阳性细胞数×100%。
1.4.2 茜素红染色观察
取 1 个 24 孔板，加入茜素红染色液室温染色 30 min，去除染色液后以 PBS 漂洗 2 次，光镜下观察矿化结节染色情况，呈红色的为矿化结节。随机选择 5 个视野拍照，并按以下公式计算各组细胞矿化结节相对比例：实验组矿化结节数/对照组矿化结节数×100%。
1.4.3 qRT-PCR 检测各组细胞相关基因表达
取 1 个 24 孔板收集各组细胞，以 RNAiso Plus 提取细胞总 RNA，然后以逆转录试剂盒将其逆转录成 cDNA，采用 qRT-PCR 试剂盒进行定量 PCR 反应。miR-335-5p、BMP-2、Runx2、OPN、OCN、U6、GAPDH 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；使用 GADPH 作为 BMP-2、Runx2、OPN、OCN 的内参基因，U6 作为 miR-335-5p 的内参基因。操作步骤、反应体系的配制、反应条件的设定均参照说明书进行。以 2–ΔΔCt法对数据进行分析，得出各组各目的基因的 mRNA 相对表达量。qRT-PCR 引物序列见表1。
表1
qRT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence of qRT-PCR
1.4.4 Western blot 检测各组细胞相关蛋白表达
取 1 个 24 孔板收集各组细胞，使用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白后，以 BCA 试剂盒测定其总浓度，具体步骤均按说明书进行。将各组蛋白浓度调整至相同，煮沸变性后取相同体积蛋白样品液行 SDS-PAGE 电泳分离蛋白，然后将其转移至硝酸纤维膜上，5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h。根据相对分子质量截取目的蛋白条带置于孵育盒中，分别加入兔源 BMP-2、Runx2、OPN、OCN 及 GAPDH 一抗，4℃ 孵育过夜，TBST 漂洗 3 次；加入羊抗兔二抗，室温孵育 2 h，TBST 漂洗 3 次；以 ECL 显色，使用凝胶成像系统拍摄蛋白条带，并以 Image Lab 软件分析各组各蛋白相对表达量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS24.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，各组与对照组间比较采用 Dunnett t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 ALP 染色观察
A、B、C、D、E 组 ALP 阳性细胞相对比例分别为 100%、159.81%±30.18%、98.43%±21.46%、21.13%±5.12%、100.96%±22.01%。与 A 组比较，B 组 ALP 阳性细胞相对比例明显升高，D 组明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；C、E 组无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。
图1
各组细胞 ALP 染色观察（×200）
箭头示 ALP 阳性细胞 a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure1. ALP staining observation of cells in each group (×200)Arrow indicated ALP positive cells a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.2 茜素红染色观察
A、B、C、D、E 组细胞矿化结节相对比例分别为 100%、205.18%±52.67%、99.54%±22.05%、23.38%±5.26%、98.96%±21.18%。与 A 组比较，B 组矿化结节相对比例明显升高，D 组明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；C、E 组无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。
图2
各组细胞茜素红染色观察（×200）
箭头示矿化结节 a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure2. Alizarin red staining observation of cells in each group (×200)Arrow indicated mineralized nodule a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3 qRT-PCR 检测各组细胞相关基因表达
与 A 组比较，B 组细胞 miR-335-5p 及 BMP-2、OCN、OPN、Runx2 mRNA 相对表达量均明显升高，D 组均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；C、E 组无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2
qRT-PCR 检测各组细胞相关基因 mRNA 相对表达量（n=3，
）
Table2.
The relative mRNA expressions of related genes in each group detected by qRT-PCR (n=3, 
)
2.4 Western blot 检测各组细胞相关蛋白表达
与 A 组比较，B 组细胞 Runx2、OPN、OCN、BMP-2 蛋白相对表达量均明显升高，D 组均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；C、E 组无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3，图3。
表3
Western blot 检测各组细胞相关蛋白相对表达量（n=3，
）
Table3.
The relative expressions of related proteins in each group detected by Western blot (n=3, 
)
图3
Western blot 检测各组细胞相关蛋白表达
Mr：相对分子质量 1：A 组 2：C 组 3：B 组 4：E 组 5：D 组
Figure3. Western blot analysis of related protein expression in each groupMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group C 3: Group B 4: Group E 5: Group D
3 讨论
骨组织是一个连续的动态平衡组织，主要由成骨细胞和破骨细胞组成，成骨细胞促进骨形成，破骨细胞促进骨吸收，从而形成正常的骨代谢平衡，调控骨代谢平衡对骨质疏松、骨折、骨缺损等骨疾病的治疗具有重要意义[12]。hBMSCs 具有成骨分化潜能[13]，在骨质疏松症的临床治疗以及骨组织工程修复骨缺损中具有关键作用[14]。因此，关于 hBMSCs 成骨分化的探讨是临床研究热点。研究表明 miRNA 对细胞增殖、凋亡及干细胞的分化具有重要调控作用，其中 miR-335-5p 与骨组织代谢平衡直接相关，能介导骨质疏松、骨关节炎等骨疾病的发生发展，还可作为骨质疏松患者骨转换的标志物[15-16]。另外，miR-335-5p 可上调成骨相关因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表达，促进成骨前体细胞分化，增强骨形成[5-6, 17]，但其对 hBMSCs 成骨分化的影响还未见报道。本研究以 miR-335-5p mimics 及 inhibitor 分别处理 hBMSCs 细胞系，结果显示，miR-335-5p mimics 可上调细胞 miR-335-5p 表达，上调 Runx2、OPN、OCN mRNA 及蛋白表达，提高其 ALP 阳性细胞、矿化结节相对比例，表明上调 miR-335-5p 水平可促进成骨相关因子表达，增强成骨分化。miR-335-5p inhibitor 处理后，上述指标变化与 miR-335-5p mimics 相反，表明下调 miR-335-5p 水平可抑制成骨相关因子表达，减弱成骨分化。
BMP-2 是一种有效的成骨细胞生长和分化的诱导因子，具有极强的促进骨细胞外基质合成及成骨分化的作用，被广泛应用于骨修复治疗[18]；还可促进 BMSCs 成骨分化，通过阻断 BMP-2 信号可减弱骨形成，抑制血管钙化[19-20]。因此，可推测 miR-335-5p 可能通过调控 BMP-2 影响 hBMSCs 成骨分化。本研究结果显示，miR-335-5p mimics 可上调 hBMSCs 中 BMP-2 mRNA 及蛋白表达水平，促进成骨分化；miR-335-5p inhibitor 可下调 hBMSCs 中 BMP-2 mRNA 及蛋白表达水平，抑制成骨分化。表明 miR-335-5p 对 hBMSCs 中 BMP-2 表达有正调控作用，并可促使成骨分化。提示调控 BMP-2 表达可能是 miR-335-5p 介导 hBMSCs 成骨分化的作用机制。
综上述，miR-335-5p 可调控 hBMSCs 的成骨分化，上调 miR-335-5p 表达可促进 hBMSCs 中成骨相关因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表达，增强成骨分化；下调 miR-335-5p 表达可抑制 hBMSCs 中成骨相关因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表达，减弱成骨分化。表明 miR-335-5p 是治疗骨质疏松症、骨缺损、骨折等的一个新靶点，为临床治疗各种骨疾病提供了新的思路，其作用机制可能是调控 BMP-2 表达。但本研究未通过上调或下调 BMP-2 的表达对其进行对照验证，尚存在不足，其更为精确完整的作用机制还需进一步深入研究。
作者贡献：黄振明、钱静负责实验设计及实施；蔡卓负责数据收集整理；汪建雄负责统计分析；黄振明负责文章撰写；胡宁对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
人 BMSCs（human BMSCs，hBMSCs）是人骨髓基质中的一种具有多向分化潜能的细胞亚群[1]，在特定条件诱导下可分化为成肌细胞、软骨细胞、成骨细胞、脂肪细胞等细胞系[2]。hBMSCs 的成骨分化与骨质疏松症的发生发展密切相关[3]，且在骨组织工程中发挥重要作用[4]。因此探讨 BMSCs 的成骨分化机制，提高其分化能力，具有重要意义。微小 RNA（micro RNA，miR）-335-5p 是一种进化上高度保守的非编码单链小分子 RNA，可介导 MSCs 的成骨、成脂及成软骨分化[5]，在成骨细胞中高表达，可通过下调 Wnt 拮抗剂 DKK1 的表达促进成骨细胞增殖和分化，增强骨形成及骨再生[6-7]。BMP-2 属于 TGF-β 超家族，具有促进成骨细胞生长和分化的作用[8]，能增强骨细胞外基质合成，并可促进 MSCs 成骨分化，广泛用于骨组织工程研究，对临床骨组织缺损、软骨损伤、骨再生等的疗效确切[9-10]。但 miR-335-5p 是否可通过调控 BMP-2 促进 hBMSCs 成骨分化，目前还不清楚。本研究通过过表达或抑制体外培养的 hBMSCs 细胞系中 miR-335-5p 表达，对 miR-335-5p 通过调控 BMP-2 对 hBMSCs 成骨分化的影响进行研究。
1 材料与方法
1.1 实验细胞、试剂及仪器
hBMSCs（上海中乔新舟生物科技有限公司）；miR-335-5p mimics（模拟物）、miR-335-5p mimics 阴性对照、miR-335-5p inhibitor（抑制剂）、miR-335-5p inhibitor 阴性对照（上海吉玛基因有限公司）；H-DMEM 培养基（上海微科生物技术有限公司）；FBS、PBS 缓冲液、胰蛋白酶-EDTA 消化液、青链霉素混合液（北京索莱宝科技有限公司）；Opti-MEM 减血清培养基、LipofectamineTM2000（Invitrogen 公司，美国）；ALP 染色试剂盒（上海士锋生物科技有限公司）；茜素红染色液（上海联硕生物科技有限公司）；RNAiso Plus、逆转录试剂盒、实时荧光定量 PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，qRT-PCR）试剂盒（Takara 公司，日本）；兔源 BMP-2、Runt 相关转录因子 2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、骨桥蛋白（osteopontin，OPN）、骨钙素（osteocalcin，OCN）及 GAPDH 一抗、羊抗兔二抗（Abcam 公司，美国）；蛋白提取试剂盒（上海生工生物工程股份有限公司）；BCA 试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）。
CKX41-F32F 光学显微镜（Olympus 公司，日本）；3900 型高通量 DNA 合成仪（美国应用生物系统公司）；Centrifuge 5424R 低温高速离心机（Eppendorf 公司，德国）；CFX96 Touch Deep Well qRT-PCR 仪、1659001 蛋白电泳仪、Trans-Blot Turbo 转膜仪（Bio-Rad 公司，美国）；IBright CL 1500 凝胶成像系统（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；恒温水浴锅（上海析达仪器有限公司）；XB-70 制冰机（GRANT 公司，美国）。
1.2 细胞培养
将冻存的 hBMSCs 细胞株置于 39 ℃ 水浴中快速冻融，然后离心（1 000×g，5 min）；取细胞沉淀，加入完全培养基（500 mL H-DMEM 培养基中含 10%FBS、100 U/mL 青链霉素混合液）重悬，接种至 25 cm2培养瓶中，放入 37 ℃、5%CO2 培养箱中培养。当细胞生长至融合率 85% 左右时，胰蛋白酶-EDTA 消化后以完全培养基重悬，按 1∶3 比例传代培养。
1.3 实验分组及方法
待第 2 代 hBMSCs 融合率达 85% 左右时，以胰蛋白酶-EDTA 消化后重悬，吹打均匀后计数，以 5×105个/mL 密度接种于 4 个 24 孔板中，培养 24 h 后，每板细胞随机分为对照组（A 组）、miR-335-5p mimics 组（B 组）、miR-335-5p mimics 阴性对照组（C 组）、miR-335-5p inhibitor 组（D 组）、miR-335-5p inhibitor 阴性对照组（E 组），每组设 3 个复孔。参照说明书步骤，以 50 μL Opti-MEM 减血清培养基溶解 1 μL LipofectamineTM2000 混匀，同时分别以 50 μL Opti-MEM 减血清培养基溶解 miR-335-5p mimics、miR-335-5p mimics 阴性对照、miR-335-5p inhibitor、miR-335-5p inhibitor 阴性对照（浓度参照说明书）混匀，均静置 20 min。将 LipofectamineTM2000 溶液分别与 miR-335-5p mimics、miR-335-5p mimics 阴性对照、miR-335-5p inhibitor、miR-335-5p inhibitor 阴性对照溶液混匀，分别处理各组细胞，并将培养基更换成 Opti-MEM 减血清培养基培养。6 h 后再换为成骨诱导分化培养基（500 mL 完全培养基中含 10 μmol/L 地塞米松、50 μmol/L 维生素 C、10 mmol/L β-磷酸甘油钠）[11]继续培养 1 周后，收集细胞进行以下观测。其中 2 个 24 孔板中的各组细胞收集后分别用于 qRT-PCR 及 Western blot 检测；另 2 个 24 孔板中的各组细胞去除培养基后以 PBS 漂洗干净，然后加入 4% 多聚甲醛固定 2 h，用于 ALP 及茜素红染色观察。
1.4 观测指标
1.4.1 ALP 染色观察
取 1 个 24 孔板，采用 ALP 染色试剂盒对各组细胞进行染色，光镜下观察，呈紫色的为 ALP 阳性细胞。随机选择 5 个视野拍照，并按以下公式计算各组 ALP 阳性细胞相对比例：实验组阳性细胞数/对照组阳性细胞数×100%。
1.4.2 茜素红染色观察
取 1 个 24 孔板，加入茜素红染色液室温染色 30 min，去除染色液后以 PBS 漂洗 2 次，光镜下观察矿化结节染色情况，呈红色的为矿化结节。随机选择 5 个视野拍照，并按以下公式计算各组细胞矿化结节相对比例：实验组矿化结节数/对照组矿化结节数×100%。
1.4.3 qRT-PCR 检测各组细胞相关基因表达
取 1 个 24 孔板收集各组细胞，以 RNAiso Plus 提取细胞总 RNA，然后以逆转录试剂盒将其逆转录成 cDNA，采用 qRT-PCR 试剂盒进行定量 PCR 反应。miR-335-5p、BMP-2、Runx2、OPN、OCN、U6、GAPDH 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；使用 GADPH 作为 BMP-2、Runx2、OPN、OCN 的内参基因，U6 作为 miR-335-5p 的内参基因。操作步骤、反应体系的配制、反应条件的设定均参照说明书进行。以 2–ΔΔCt法对数据进行分析，得出各组各目的基因的 mRNA 相对表达量。qRT-PCR 引物序列见表1。
表1
qRT-PCR 引物序列
Table1.
Primer sequence of qRT-PCR
1.4.4 Western blot 检测各组细胞相关蛋白表达
取 1 个 24 孔板收集各组细胞，使用蛋白提取试剂盒提取细胞总蛋白后，以 BCA 试剂盒测定其总浓度，具体步骤均按说明书进行。将各组蛋白浓度调整至相同，煮沸变性后取相同体积蛋白样品液行 SDS-PAGE 电泳分离蛋白，然后将其转移至硝酸纤维膜上，5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h。根据相对分子质量截取目的蛋白条带置于孵育盒中，分别加入兔源 BMP-2、Runx2、OPN、OCN 及 GAPDH 一抗，4℃ 孵育过夜，TBST 漂洗 3 次；加入羊抗兔二抗，室温孵育 2 h，TBST 漂洗 3 次；以 ECL 显色，使用凝胶成像系统拍摄蛋白条带，并以 Image Lab 软件分析各组各蛋白相对表达量。
1.5 统计学方法
采用 SPSS24.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用方差分析，各组与对照组间比较采用 Dunnett t 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 ALP 染色观察
A、B、C、D、E 组 ALP 阳性细胞相对比例分别为 100%、159.81%±30.18%、98.43%±21.46%、21.13%±5.12%、100.96%±22.01%。与 A 组比较，B 组 ALP 阳性细胞相对比例明显升高，D 组明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；C、E 组无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见图1。
图1
各组细胞 ALP 染色观察（×200）
箭头示 ALP 阳性细胞 a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure1. ALP staining observation of cells in each group (×200)Arrow indicated ALP positive cells a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.2 茜素红染色观察
A、B、C、D、E 组细胞矿化结节相对比例分别为 100%、205.18%±52.67%、99.54%±22.05%、23.38%±5.26%、98.96%±21.18%。与 A 组比较，B 组矿化结节相对比例明显升高，D 组明显降低，差异均有统计学意义（P<0.05）；C、E 组无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见图2。
图2
各组细胞茜素红染色观察（×200）
箭头示矿化结节 a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure2. Alizarin red staining observation of cells in each group (×200)Arrow indicated mineralized nodule a. Group A; b. Group B; c. Group C; d. Group D; e. Group E
2.3 qRT-PCR 检测各组细胞相关基因表达
与 A 组比较，B 组细胞 miR-335-5p 及 BMP-2、OCN、OPN、Runx2 mRNA 相对表达量均明显升高，D 组均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；C、E 组无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。
表2
qRT-PCR 检测各组细胞相关基因 mRNA 相对表达量（n=3，）
Table2.
The relative mRNA expressions of related genes in each group detected by qRT-PCR (n=3, )
2.4 Western blot 检测各组细胞相关蛋白表达
与 A 组比较，B 组细胞 Runx2、OPN、OCN、BMP-2 蛋白相对表达量均明显升高，D 组均明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；C、E 组无明显变化，差异无统计学意义（P>0.05）。见表3，图3。
表3
Western blot 检测各组细胞相关蛋白相对表达量（n=3，）
Table3.
The relative expressions of related proteins in each group detected by Western blot (n=3, )
图3
Western blot 检测各组细胞相关蛋白表达
Mr：相对分子质量 1：A 组 2：C 组 3：B 组 4：E 组 5：D 组
Figure3. Western blot analysis of related protein expression in each groupMr: Relative molecular mass 1: Group A 2: Group C 3: Group B 4: Group E 5: Group D
3 讨论
骨组织是一个连续的动态平衡组织，主要由成骨细胞和破骨细胞组成，成骨细胞促进骨形成，破骨细胞促进骨吸收，从而形成正常的骨代谢平衡，调控骨代谢平衡对骨质疏松、骨折、骨缺损等骨疾病的治疗具有重要意义[12]。hBMSCs 具有成骨分化潜能[13]，在骨质疏松症的临床治疗以及骨组织工程修复骨缺损中具有关键作用[14]。因此，关于 hBMSCs 成骨分化的探讨是临床研究热点。研究表明 miRNA 对细胞增殖、凋亡及干细胞的分化具有重要调控作用，其中 miR-335-5p 与骨组织代谢平衡直接相关，能介导骨质疏松、骨关节炎等骨疾病的发生发展，还可作为骨质疏松患者骨转换的标志物[15-16]。另外，miR-335-5p 可上调成骨相关因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表达，促进成骨前体细胞分化，增强骨形成[5-6, 17]，但其对 hBMSCs 成骨分化的影响还未见报道。本研究以 miR-335-5p mimics 及 inhibitor 分别处理 hBMSCs 细胞系，结果显示，miR-335-5p mimics 可上调细胞 miR-335-5p 表达，上调 Runx2、OPN、OCN mRNA 及蛋白表达，提高其 ALP 阳性细胞、矿化结节相对比例，表明上调 miR-335-5p 水平可促进成骨相关因子表达，增强成骨分化。miR-335-5p inhibitor 处理后，上述指标变化与 miR-335-5p mimics 相反，表明下调 miR-335-5p 水平可抑制成骨相关因子表达，减弱成骨分化。
BMP-2 是一种有效的成骨细胞生长和分化的诱导因子，具有极强的促进骨细胞外基质合成及成骨分化的作用，被广泛应用于骨修复治疗[18]；还可促进 BMSCs 成骨分化，通过阻断 BMP-2 信号可减弱骨形成，抑制血管钙化[19-20]。因此，可推测 miR-335-5p 可能通过调控 BMP-2 影响 hBMSCs 成骨分化。本研究结果显示，miR-335-5p mimics 可上调 hBMSCs 中 BMP-2 mRNA 及蛋白表达水平，促进成骨分化；miR-335-5p inhibitor 可下调 hBMSCs 中 BMP-2 mRNA 及蛋白表达水平，抑制成骨分化。表明 miR-335-5p 对 hBMSCs 中 BMP-2 表达有正调控作用，并可促使成骨分化。提示调控 BMP-2 表达可能是 miR-335-5p 介导 hBMSCs 成骨分化的作用机制。
综上述，miR-335-5p 可调控 hBMSCs 的成骨分化，上调 miR-335-5p 表达可促进 hBMSCs 中成骨相关因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表达，增强成骨分化；下调 miR-335-5p 表达可抑制 hBMSCs 中成骨相关因子 Runx2、OPN、OCN、ALP 表达，减弱成骨分化。表明 miR-335-5p 是治疗骨质疏松症、骨缺损、骨折等的一个新靶点，为临床治疗各种骨疾病提供了新的思路，其作用机制可能是调控 BMP-2 表达。但本研究未通过上调或下调 BMP-2 的表达对其进行对照验证，尚存在不足，其更为精确完整的作用机制还需进一步深入研究。
作者贡献：黄振明、钱静负责实验设计及实施；蔡卓负责数据收集整理；汪建雄负责统计分析；黄振明负责文章撰写；胡宁对文章的知识性内容作批评性审阅。
利益冲突：所有作者声明，在课题研究和文章撰写过程中不存在利益冲突。课题经费支持没有影响文章观点和对研究数据客观结果的统计分析及其报道。
