• 1. 兰州大学口腔医学院(兰州  730000);
  • 2. 兰州大学第一附属医院病理科(兰州  730000);
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目的 探讨应用细胞膜片技术构建三维真皮样组织的新策略。方法 取 2~3 周龄新西兰大白兔骨髓,采用全骨髓贴壁法分离培养兔 BMSCs(rabbit BMSCs,rBMSCs)并传代,取人皮肤成纤维细胞(human dermal fibroblasts,HDFs)传代培养。取第 2 代 rBMSCs、第 3 代 HDFs 分别于培养皿采用膜片条件培养基连续培养 2 周,获得单层细胞膜片。取人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)接种于 rBMSCs 膜片上,构建预血管化膜片。培养期间于倒置相差显微镜下观察膜片上细胞形态变化;共培养 1、3、7、14 d 后取材行 HE 染色、CD31 免疫荧光染色,观察细胞分布及微血管网络生成情况,以 rBMSCs 膜片作为对照。分别将培养 7 d 的预血管化膜片(实验组)及 rBMSCs 膜片(对照组)放于 2 层 HDFs 膜片中间,制备三维真皮样组织,培养 24 h 后行 CD31 免疫荧光染色及Ⅰ、Ⅲ型胶原免疫组织化学染色,评估细胞分布及胶原表达情况。结果 细胞连续培养 2 周后成功制备 HDFs 膜片及 rBMSCs 膜片。HUVECs 接种于 rBMSCs 膜片 3 d 后重新排列,7 d 后形成网状结构,14 d 后网状结构更明显;HE 染色见膜片间有空泡形成,且随时间延长空泡日趋明显、膜片厚度显著增加;CD31 免疫荧光染色可见微血管管腔形成。而 rBMSCs 膜片仅见细胞膜片增厚,未见细胞形态改变、空泡结构形成。三维真皮样组织观测显示,实验组内皮细胞呈阳性表达,rBMSCs、HDFs 及 HUVECs 细胞排列整齐;而对照组染色呈阴性,细胞随机排列。实验组和对照组Ⅰ、Ⅲ型胶原均呈阳性表达,与对照组比较,实验组细胞排列紧密,细胞基质分布规律,呈“蜂巢状”结构;两组Ⅰ、Ⅲ型胶原表达量差异无统计学意义(P>0.05)。结论 应用细胞膜片技术可以构建三维真皮样组织,其中采用 HUVECs 联合 rBMSCs 膜片构建预血管化膜片后细胞基质分布较规律,具有形成组织工程真皮的潜力。