• 1. 苏州市吴江区第一人民医院骨科(江苏苏州  215200);
  • 2. 南京医科大学第一附属医院脊柱外科(南京 210000);
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目的  探讨大鼠脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)后细胞自噬的变化及其与 B 淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白多位点磷酸化的关系。方法  取 40 只 8 周龄雄性 SD 大鼠,采用改良 Allen 法制备 SCI 模型;将造模成功的 36 只大鼠随机分为 SCI 组、自噬抑制剂组、自噬促进剂组,每组 12 只。另取 12 只大鼠仅切除椎板、不损伤脊髓,作为假手术组。造模结束后,自噬抑制剂组及自噬促进剂组分别于脊髓鞘内注射 20 μL 600 nmol/L 3-甲基腺嘌呤、25 nmol/L 雷帕霉素,假手术组及 SCI 组仅注射 20 μL 生理盐水;每天 1 次,连续 4 周。造模后 1 d 及 1、2、4 周,采用 BBB 评分法评价各组大鼠后肢运动功能。末次注射后 24 h 处死各组大鼠并取脊髓组织,ELISA 法检测脊髓组织中过氧化物酶(myeloperoxidase,MPO)活性及 TNF-α、IL-1β 水平;HE 染色观察脊髓组织形态学变化;透射电镜观察脊髓组织中线粒体超微结构变化;免疫荧光染色检测自噬相关蛋白(Beclin1)、微管相关蛋白轻链 3(microtubule-associated protein light chain 3,LC3)蛋白表达;TUNEL 染色观察脊髓组织神经细胞凋亡;免疫荧光双染检测 LC3/TUNEL 阳性细胞表达;Western blot 检测细胞 Bcl-2 相关 X 蛋白 (Bcl-2 associated X protein,Bax)、Bcl-2 及 p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达。结果  与假手术组相比,SCI 组各时间点 BBB 评分降低,MPO 活性、TNF-α、IL-1β 水平升高;神经细胞周围间隙增大,细胞肿胀、出现空泡,线粒体中出现自噬小体;Beclin1 及 LC3 蛋白阳性率、神经细胞凋亡率显著升高;LC3、TUNEL 阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2 蛋白表达降低;以上指标比较差异均有统计学意义(P<0.05)。与 SCI 组相比,自噬抑制剂组各时间点 BBB 评分降低,MPO 活性、TNF-α、IL-1β 水平升高;线粒体中出现少量自噬囊泡;Beclin1 及 LC3 蛋白阳性率降低,神经细胞凋亡率显著升高;LC3 阳性细胞减少、TUNEL 阳性细胞增多;Bax、p-Bcl-2(Ser87)、p-Bcl-2(Ser70)蛋白表达升高,Bcl-2 蛋白表达降低。而自噬促进剂组结果与自噬抑制剂组相反;以上指标组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。结论  大鼠 SCI 后通过诱导细胞自噬可降低神经细胞凋亡,保护脊髓功能,其机制可能与抑制 Bcl-2 蛋白多位点磷酸化有关。

引用本文: 翁峰标, 朱立帆, 杨立文, 李勇, 刘荣, 凡进, 周建新. B 淋巴细胞瘤-2 蛋白多位点磷酸化在大鼠脊髓损伤后细胞自噬中的表达研究. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(5): 618-627. doi: 10.7507/1002-1892.201812064 复制

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