张庆宇 1,2 , 高福强 2 , 程立明 2 , 刘立华 1,2 , 孙伟 1,2,3 , 李子荣 2
  • 1. 北京协和医学院研究生院(北京 100730);
  • 2. 中日友好医院骨科(北京 100029);
  • 3. 中日友好医院骨坏死与关节保留重建中心(北京 100029);
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目的评估淫羊藿苷对低浓度糖皮质激素诱导的骨微血管内皮细胞(bone microvascular endothelial cells,BMECs)自噬和外泌体分泌的影响。方法从行全髋关节置换术切取的股骨头中分离 BMECs,用一系列低浓度梯度氢化可的松(0、0.03、0.06、0.10 mg/mL)干预(设为 A、B、C、D 组),在此基础上再用 5×10−5 mol/L 淫羊藿苷干预(设为 A1、B1、C1、D1 组),24 h 后采用 Western blot 检测自噬相关蛋白微管相关蛋白轻链 3B(microtubule-associated protein 1 light chain 3B,LC3B)及死骨片 1(p62)的表达。从经淫羊藿苷处理(干预组)和未经淫羊藿苷处理(未干预组)的 BMECs 中提取外泌体,纳米颗粒跟踪分析技术检测其直径和浓度,BCA 法检测外泌体总蛋白质含量,Western blot 检测外泌体 CD9、CD81、TGF-β1 和 VEGFA 蛋白的表达。进一步将 BMECs 分为 3 组,实验组和对照组分别分离经或未经淫羊藿苷处理的 BMECs 分泌的外泌体,与 BMECs 共培养;空白对照组为单纯 BMECs。氢化可的松处理后,采用 Western blot 检测 LC3B 和 p62 表达,划痕实验检测细胞迁移能力,并观察血管生成能力。结果随氢化可的松浓度升高,各组 LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量逐渐增加,p62 蛋白相对表达量减少,各组间差异均有统计学意义(P<0.01);相同激素浓度下,淫羊藿苷干预后,LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量减少,p62 蛋白相对表达量增加(P<0.01)。干预组外泌体浓度显著高于未干预组(t=−10.191,P=0.001);两组外泌体直径和总蛋白质含量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。未干预组和干预组 CD9 和 CD81 蛋白均高度表达;干预组 VEGFA/CD9 和 TGF-β1/CD9 蛋白相对表达量比值均显著高于未干预组(P<0.01)。外泌体共培养后,空白对照组、对照组和实验组中 p62 蛋白相对表达量呈递增趋势,LC3B-Ⅱ蛋白相对表达量呈递减趋势,各组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。氢化可的松处理 12、24 h 时,对照组和实验组划痕闭合率明显高于空白对照组(P<0.05),实验组明显高于对照组(P<0.05);氢化可的松处理 4、8 h 时,实验组和对照组管腔数、出芽数和小管分支长度均显著大于空白对照组(P<0.05);实验组小管分支长度和管腔数大于对照组(P<0.05)。结论淫羊藿苷及 BMECs 产生的外泌体能改善低浓度激素诱导的 BMECs 自噬,对内皮细胞起到保护作用。

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