周围神经缺损的修复是临床研究热点，神经损伤后有一定再生能力，但长距离、粗大神经损伤后仍难以自行恢复[1]。目前，临床主要采用同种异体及自体神经修复周围神经缺损，存在来源有限、组织尺寸和结构不能完全匹配，以及供区功能受损、长期失去神经支配等问题[2-3]。
人体神经系统是通过神经元生物电信号支配包括感觉和行动在内的各项日常活动[4]。如何让神经元在复杂的信号网络调控中实现有序增殖和定向生长，修复神经组织，是需要解决的难题[5-6]。如何让不同类型神经纤维准确再生，从而实现对靶器官的支配；采用何种移植物能更快地修复周围神经缺损，在靶肌肉完全萎缩前实现受损神经的再生，已成为解决神经再生的关键性难题。为此，我们设计并制备了“双导”神经移植物——聚吡咯/丝素蛋白（polypyrrole/silk fibroin，PPy/SF）纤维基导电型复合支架，它是一种“壳-芯”结构导电型神经支架。本次研究通过分析该复合支架的理化性能和生物学性能，评价其作为神经支架材料的可能性，以期为组织工程神经移植物的构建提供新的方法和思路。
1 材料与方法
1.1 主要试剂及仪器
NIH3T3 细胞株由中国科学院提供，将细胞加入含 10%FBS 的 DMEM 中，于 37℃、5%CO2 培养箱中孵育，每 2 天换液 1 次，选择对数生长期细胞进行实验研究。CaCl2/H2O/C2H5OH 三元溶剂体系，无水 CaCl2、无水 C2H5OH、三蒸水按照 1∶2∶8 比例配置，使用前配制。天然蚕丝（直径 20/22D；浙江德清新联制丝有限公司）；甲酸、盐酸、三氯化铁、无水碳酸钠（阿拉丁生化科技股份有限公司）；PPy（Sigma 公司，美国）；细胞计数试剂盒 8（cell counting kit 8，CCK-8；碧云天生物技术有限公司）。Regenovo 型 3D 打印机（捷诺飞生物科技股份有限公司）；自制滚筒式静电纺丝装置（由高压电源设备、阳极发生器和阴极收集器组成）；TFW-5S 电子万能试验机（上海拓丰仪器科技有限公司）；Milli-Q 纯水设备（Millipore 公司，德国）；AUY120 电子分析天平（SHIMADZU 公司，日本）；DF-101S 集热式电热恒温磁力搅拌器（巩义市予华仪器责任有限公司）；Model 2000 数字万用表（Keithley 公司，美国）。
1.2 PPy/SF 纤维基导电型复合支架的制备
1.2.1 原料处理
① 以 1∶50 比例（M/V）将天然蚕丝置于 0.05% Na2CO3 溶液，煮沸脱胶，重复 3 次，得到脱胶的再生丝素 SF[7]。② SF 置于 CaCl2/H2O/C2H5OH 三元溶剂体系中完全溶解，得到黄色透明溶液，与聚环氧乙烷搅拌充分，制备 3D 打印浆料。③ 另将 SF 与三元溶解体系溶解后的黄色透明溶液置于透析袋中，在 Millipore 水中透析，收集得到 SF 溶液，平铺在平皿中室温晾干，得到再生丝素膜，将该膜溶解于甲酸后得到静电纺丝溶液。④ PPy 减压蒸馏提纯，–20℃ 备用。
1.2.2 导电纤维结构的设计和制备
将上述 3D 打印浆料倒入 Regenovo 型 3D 打印机料筒中，选择合适的参数（打印气压 0.10 MPa，速度 16 mm/s），按照取向性排列进行打印，即得到取向性排列的 3D 原始 SF 内芯，乙醇处理成型。利用电化学沉积技术，使导电聚合物 PPy 沉积在 SF 内芯上，形成黑色特征的 PPy 外壳[8-9]，构建“壳-芯”结构的 PPy/SF 导电纤维，作为实验组。另取 PPy 直接进行 3D 打印，形成无 SF 内芯的 PPy 导电纤维，作为对照组。
1.2.3 纤维基导电型复合支架的制备
将上述制备的静电纺丝溶液装入自制滚筒式静电纺丝装置的微量注射泵中，作为阳极发生器；阴极收集器是绝缘收集板制成的高压电源，滚筒接收器自制；两者距离为 8～15 cm，通过微量注射泵维持静电纺丝溶液恒定体积流速 0.1～0.3 mL/h。施加 18～22 kV 电压，收集于接收器上从而形成静电纺丝膜。将实验组和对照组的导电纤维作为基底，平行于静电纺喷丝方向放于接收装置，静电纺纳米丝素纤维的排列与导电纤维方向一致，纳米丝素纤维包覆导电纤维后，再继续进行无序静电纺丝，直至形成相应厚度和大小的支架，即纤维基导电型复合支架。通过改变接收装置制备两种形式支架用于实验，包括复合膜和复合导管（直径2.0 mm）。
1.3 观测指标
1.3.1 表面性状观察
取实验组复合导管进行大体观察，光镜下观察其内表面和外表面，扫描电镜观察其“壳-芯”结构。
1.3.2 稳定性检测
取两组复合膜剪裁为 10 mm×10 mm×1 mm，置于 24 孔板，于 37℃ 分别浸泡于蒸馏水或 DMEM 中，每孔 1 mL；放置于摇床后，以 100 r/min 摇动。于浸泡 0、1、3、5、10、20、30 d 两组各取 6 孔样本（每孔 3 个样本），干燥后于光镜下观察材料表面形貌，计数结构完整的样本，计算支架稳定性（结构完整样本数/样本总数×100%）。
1.3.3 生物力学检测
取两组复合膜裁剪为 20 mm×20 mm×1 mm，浸泡于纯水 4 h 后取出。用千分尺精确量取尺寸，然后使用电子万能试验机进行拉伸试验（每组 6 个样本），于室温条件下以 5 mm/min 速度进行拉伸，膜断裂时的拉力视为复合膜所能承受的最大抗拉伸强度。
1.3.4 导电性检测
取实验组复合膜和 3D 打印制备的原始 SF 内芯，每组 6 个样本。利用数字万用表在室温下用双探针法测量支架电阻率：将表笔线的测试端并联到被测电阻上（被测样本的平整表面上），被测电阻值将同时显示在显示屏上，根据理论公式 ρ=Rπr2/t（R 是电阻，r 是半径，t 是样本厚度），计算支架导电性。由于支架材料表面结构具有取向性，因此选择多个方向进行测量，每个样本至少测量 5 次。同时，实验组测量不同“壳-芯”结构纤维直径（80、120、180 μm）和不同距离（相邻“壳-芯”结构纤维间距离 500 μm 和 700 μm）的复合膜。具体分组方法：a1 为直径 80 μm、距离 500 μm；a2 为直径 120 μm、距离 500 μm；a3 为直径 180 μm、距离 500 μm；b1 为直径 80 μm、距离 700 μm；b2 为直径 120 μm、距离 700 μm；b3 为直径 180 μm、距离 700 μm。
1.3.5 降解性检测
取两组复合膜裁剪成 10 mm×10 mm×1 mm，分别置于 0.01 mol/L PBS（pH7.4）和蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中，观察复合膜降解情况。将蛋白酶 ⅩⅣ 粉末溶解于 PBS 中配置成浓度为 1 U/mL 溶液，现配现用。具体方法：将样本放入 60℃ 烘箱至恒重（称量差异<0.03%），分析天平称量样本质量，记录为 W0，放入离心管中编号；再用分析天平称量离心管和样本的总质量（不含盖），记录为 W1。在离心管中分别倒入 5 mL PBS 或蛋白酶 ⅩⅣ 溶液，置于 37℃ 恒温振荡器中，每天换液 1 次。于 1、2、3、4 周时每组分别取出 5 管，以离心半径 26 cm、4 000 r/min 离心 10 min，弃去液体后倒入三蒸水再次洗涤离心（离心条件同上），重复 3 次后将离心管置于 60℃ 真空干燥箱 18 h，待导管中的水分完全蒸发、质量达恒重后，使用分析天平再次称量，记录为 W2。按以下公式计算支架降解率：（W1–W2）/W0×100%。
1.3.6 生物活性检测
实验分为 3 组，分别取纤维基导电型复合膜（A 组）、单纯 PPy 导电纤维（B 组）、静电纺单纯 SF 纤维（C 组）放入 24 孔板内，每组 2 孔。每孔加入 500 μL 70%～75% 乙醇消毒 20～30 min 后，用等量 0.01 mol/L PBS 洗涤 3 次，吹干后备用。① 细胞形态观察：将 NIH3T3 细胞按 5×105 个/mL 密度接种于各组材料上，每孔 500 μL，于 37℃、5%CO2 培养箱内培养。于培养 30、60、90、120、360、720 min 用 4% 多聚甲醛固定后，以 0.01 mol/L PBS 清洗 3 次后，甲苯胺蓝染色 15 min，光镜下观察支架上细胞形态。② 细胞增殖检测：将 NIH 3T3 细胞按 1×105 个/mL 密度接种于各组材料上，每孔 500 μL ，置于 37℃、5%CO2 细胞培养箱内培养。于培养 1、3、5 d 时采用 CCK-8 法检测细胞增殖情况，以吸光度（A）值表示[10]。
1.4 统计学方法
采用 SPSS17.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，两组间比较采用独立样本 t 检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 SNK 检验；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 表面性状观察
大体观察示，实验组纤维基导电型复合导管内层镶嵌均匀排列的导电纤维，导电纤维呈现 PPy 沉积反应后的黑色外观。光镜观察示纤维基导电型复合导管内层由取向排列的 PPy 导电纤维和静电纺取向性 SF 纳米纤维膜组成，纤维均呈平行取向性排列；外层由静电纺 SF 纳米纤维组成，纤维随机排列，交错缠绕，形成大大小小的孔隙。扫描电镜观察导电纤维呈壳层包绕芯层式样的“壳-芯”结构，与导管呈轴向平行排列。见图 1。
图1
实验组 PPy/SF 纤维基导电型复合支架表面性状观察
a. 大体观察；b. 扫描电镜观察（×500）；c. 支架内层光镜观察（×50）；d. 支架外层光镜观察（×50）
Figure1. Surface character observation of the PPy/SF fiber-based composite conductive scaffold in experimental groupa. Gross observation; b. Scanning electron microscope observation (×500); c. Light microscopic observation of inner layer of scaffold (×50); d. Light microscopic observation of outer layer of scaffold (×50)
2.2 稳定性测试
两组支架材料浸泡于蒸馏水后，实验组早期“壳-芯”结构支架无分层，结构保持完整；随时间延长，支架大多数保持清晰完整的“壳-芯”结构，仅有极少量出现剥落现象。对照组无芯结构支架表面从早期即开始出现小的碎片和分层，稳定性较差；随时间延长支架完整性逐渐丢失。浸泡 1 d 后各时间点实验组支架稳定性均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05），见图 2a。
图2
两组支架稳定性检测
a. 支架浸泡于蒸馏水；b. 支架浸泡于 DMEM
Figure2. Stability tests for two groups of the conductive scaffoldsa. Samples soaked in water; b. Samples soaked in DMEM
两组支架浸泡于 DMEM 后，对照组无芯结构支架从早期即出现许多碎片或分层；2 d 后发现许多样本的取向性条纹扭曲、剥落，甚至崩溃。而实验组“壳-芯”结构支架的取向性条纹结构在浸泡期间仍清晰并保持良好，浸泡 30 d 时支架稳定性仍保持近 50%。浸泡 1 d 后各时间点实验组支架稳定性均高于对照组，差异有统计学意义（P<0.05）。见图 2b。
2.3 生物力学试验
对照组无芯结构支架抗拉伸强度为（0.58±0.01）N，显著低于实验组“壳-芯”结构支架（1.10±0.01）N，差异有统计学意义（t=28.31，P=0.00）。
2.4 导电性检测
3D 原始 SF 内芯在仪器所测范围内未显示导电性（仪器灵敏度为 1×10–11 S/cm）。而实验组支架的导电性为 8.45×10–4～1.56×10–3 S/cm；相同距离下导电性随纤维直径增大而增大，而相同纤维直径下不同距离的导电纤维导电性比较无明显差异。见图 3。
图3
不同导电纤维导电性检测
Figure3.
Electrical conductivity of different conductive fibers
2.5 降解性检测
在 PBS 溶液中，两组支架质量变化均较小，各时间点两组降解率比较差异均无统计学意义（P>0.05）。在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中，实验组支架质量变化较大，1 周时降解不明显，随时间延长形成细小碎片，2 周时质量下降明显，之后降解速度趋于平缓；对照组支架质量下降缓慢；各时间点两组降解率比较差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 4。
图4
两组支架降解率检测
a. 在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中；b. 在 PBS 中
Figure4. Degradation rate measurement of conductive scaffolds in two groupsa. In protease ⅩⅣ solution; b. In PBS
2.6 生物活性检测
2.6.1 细胞形态观察
培养 90 min 内各组细胞均呈圆形，其中 A 组在 90 min 时已有部分细胞开始长出伪足；120 min 时 A 组细胞有明显突起，而 B、C 组细胞无此现象；360、720 min 时 A、C 组细胞开始沿纤维方向平行生长，而 B 组细胞呈现多种形态，其中 A 组细胞较 B、C 组细胞有更好的取向性，且细胞突起长于 C 组。见图 5。
图5
各组培养后各时间点NIH3T3 细胞形态观察（甲苯胺蓝×50）
从左至右依次为培养 30、60、90、120、360、720 min a. A 组；b. B 组；c. C 组
Figure5. Cellular morphology observations of different groups at various time points (Toluidine blue staining×50)From left to right for cultured 30, 60, 90, 120, 360, and 720 minutes, respectively a. Group A; b. Group B; c. Group C
2.6.2 细胞增殖检测
CCK-8 法检测示，随培养时间延长，各组细胞均逐渐增殖。各时间点 A 组 A 值均显著高于 B、C 组，C 组高于 B 组，差异均有统计学意义（P<0.05）。见图 6。
图6
CCK-8 法检测各组 NIH3T3 细胞增殖
Figure6.
The proliferation of NIH3T3 cells of different groups determined by CCK8 assay
3 讨论
神经再生研究的关键是寻找理想的组织工程支架材料[11]。考虑到神经组织、细胞的结构组成和电生理学特性，理想的神经支架材料除需具备独特形貌特征，以改善与其接触的神经细胞间的相互作用、调控细胞的生长分化，还需要具备与在体神经形成良好电生理整合的能力[12]。针对上述问题，近年来研究人员开始研究新型导电型生物材料[13]。PPy 因其优良的理化性能和良好的生物相容性，现已被用于细胞生长基质和作为电学记录材料，其在组织工程生物医用领域方面具有潜在的应用价值。但 PPy 存在力学性能差、不可降解、缺少活性基团等缺陷，目前研究主要是将其与其他生物材料制成复合材料[14]。SF 是天然蛋白材料，具有良好的生物相容性、降解可调控等特性，PPy 是一种共轭聚合物，其与 SF 大分子链的肽链有一定的相互作用，可以形成稳定的导电聚合物，因此本研究拟用 SF 与 PPy 形成导电型复合物[15-16]。
稳定性和力学性能是组织工程支架材料重要参数。材料植入体内一定时间内仍需要保持有效的形状，使其能够在体内承受一定压力；同时，在植入手术过程中也要保持结构完整和稳定。本研究表明，单纯 PPy 纤维导电膜无内芯结构，极容易由于拉伸发生变形或是断裂拉断，影响其应用；而“壳-芯”结构中 SF 与 PPy 的结合可以形成优势互补，材料的拉伸性也得到显著提升，“壳-芯”结构能够增强复合支架的力学拉伸性。
生物材料的种类会不同程度影响导电聚合物的导电性、形貌及稳定性。我们在预实验中选择不同的导电材料作为外壳，不同的天然材料作为内芯，将导电材料和天然材料进行不同的组合，制备出不同的复合材料。结果表明 PPy 外壳、SF 内芯制备的纤维基导电型复合支架相较于其他材料组合，生物稳定性高，电活性维持长久，因此优选该组合用于制备纤维基导电型复合支架中的“壳-芯”结构。本研究结果与文献报道一致，PPy 与影响 SF 大分子链的肽链有一定的相互作用，SF 和 PPy 可以形成稳定的导电聚合物[17-18]。
理想的组织工程神经支架应具备良好的生物可降解性，植入体内后可以被机体降解吸收，而且其降解速度与再生匹配为宜[19]。本研究结果显示，PBS 溶液中，“壳-芯”结构 PPy/SF 纤维基导电型复合支架和对照组单纯 PPy 导电纤维的质量变化都非常小。相对而言，在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中，单纯 PPy 导电纤维质量仍无明显变化，说明 PPy 沉积的 SF 不容易被降解。这主要是由于 PPy 化学沉积在 SF 表层，PPy 分子链具有高度刚性，难溶于一般溶剂，对 SF 纤维起到了保护作用。而 PPy/SF 纤维基导电型复合支架在蛋白酶 ⅩⅣ 溶液中的质量变化则较大，实验早期质量损失较少，因为 SF 肽链仅仅只是被分解成多肽，相对分子质量依然较大，仍然能够维持原有结构；而随着降解时间延长，在酶的作用下，蛋白的多肽结构被进一步分解，形成细小的碎片，同时 SF 结构中可溶性部分也被释放到溶液中，因此质量下降明显。
生物活性是组织工程支架材料生物相容性评价的重要组成部分，支架材料应具有良好的细胞相容性，能够促进细胞的黏附、铺展、迁移、增殖以及分化等行为，并能有效维持细胞正常的表型与生理功能[20]。本研究结果显示，NIH3T3 细胞在 PPy/SF 纤维基导电型复合支架上黏附能力优于其他材料，细胞增殖活力高于其他材料。这可能是由于静电纺丝技术制备的支架材料比表面积较高、纳米纤维直径接近于细胞外基质的纤维尺寸，同时生物电在一定范围内可以起到促进细胞生长的作用，从而有利于细胞的识别，促进细胞的黏附、生长[21-22]。
生物材料不仅可以为组织和器官生长、修复提供三维结构和机械支撑，其自身的一些物理化学信号还可以调控再生速率，影响再生进程，尤其是材料的表面拓扑结构[23-24]。PPy/SF 纤维基导电型复合支架内膜由取向性纳米丝素纤维和 PPy 导电纤维定向排列组成，能够引导细胞定向生长，促进轴突生长。静电纺外膜孔隙率结构可以实现物质交换，有效促进神经修复。
综上述，在有取向性的纤维状导电材料基础上进行 SF 静电纺丝，可以制备成膜和导管形式的 PPy/SF 纤维基导电型复合支架。该复合支架具备稳定性好、力学性能优越、电活性维持长久等理化性能；同时可以通过调节 3D 打印参数制备不同尺寸的 PPy/SF 纤维基导电型复合支架，具有合适导电性大小的 PPy/SF 纤维基导电型复合支架有利于细胞附着在表面，且细胞状态良好，增殖活性强。因此，本研究制备的 PPy/SF 纤维基导电型复合支架可作为组织工程神经支架材料。
