引用本文： 张忆, 梁艳, 笪琳萃, 解慧琪. 一种用于复合材料观察的快速病理制片方法研究. 中国修复重建外科杂志, 2019, 33(1): 80-84. doi: 10.7507/1002-1892.201806094 复制
结合天然细胞外基质和高分子材料的优点，通过物理或化学的方法将这两类材料进行复合，制备更符合临床需求的复合材料，是目前组织工程支架材料的研究热点[1-3]。这类复合材料已用作食管、神经、腹壁以及心室壁等组织修复重建的支架材料，并取得较好的修复效果[4-6]。我们在前期研究中制备了具有多孔结构的聚氨酯-小肠黏膜下层（polyurethane/small intestinal submucosa，PU/SIS）复合材料，并证实其兼具合成材料和生物源性材料的优点，既具有优异的回弹性能、降解性能，还具有良好的细胞相容性和组织相容性，并能在一定程度上促进血管新生，在组织工程领域具有广阔的应用前景[7]。在实验研究中我们发现，传统的病理制片方法不仅会对高分子合成材料的形态结构造成溶解和破坏，而且无法用于观察复合材料两种组分的分布情况。而复合材料中各组分的分布情况对其质量控制以及治疗效果有重要意义，寻找一种可行的病理制片方法对这类复合材料进行表征具有重要意义。我们结合前期的制片经验，摸索出一套简便快捷的制片方法，该方法不仅可用于观察复合材料中细胞外基质成分的分布情况，还有望应用于其他含有高分子合成材料的复合材料的组织学评价。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料及主要试剂、仪器
伊红（MERCK 公司，德国）；无水乙醇（成都科隆化学品有限公司）；TO 型生物透明剂（广西岑溪市天兴林化有限公司）；中性快干胶（无锡市江原实业技贸总公司）；OCT 冰冻切片包埋剂（Tissue-Tek 公司，美国）。冰冻切片机（Leica 公司，德国）；明场显微镜（ZEISS 公司，德国）。
1.2 PU/SIS 复合材料的制备
按照文献［7］方法制备复合材料，具体如下：① 将猪小肠清洗干净，分离 SIS。经脱脂、脱细胞和低温粉碎后，过 200 目筛，消毒灭菌备用。② 将聚四氢呋喃 1000（33.33 g，33.33 mmol）、异佛尔酮二异氰酸酯（21.48 g，96.67 mmol）和辛酸亚锡（0.02 mL）加入三口烧瓶中，于 74℃ 油浴锅中反应 3 h。加入 2，2-二羟甲基丁酸（4.94 g，33.33 mmol）于 54℃ 下反应 3 h。为使反应平稳进行，必要时可使用丙酮调节体系黏度。加入三乙胺（7 mL），在室温下搅拌 20 min。将反应产物缓慢滴加至丙酮水溶液（丙酮∶去离子水=1∶4）中，以1 300 r/min 搅拌 2 h 得到 PU 乳液。③ 将 0.3 g SIS 粉末加入至 10 g 固含量为 21% 的 PU 乳液中，搅拌 2.5 h。将制备的共混体系倒入模具中，于–80℃低温冰箱中预冻后，冷冻干燥 24 h。将上述材料浸泡在 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺溶液中，37℃ 下避光反应 36 h。PBS 洗涤 5 次，每次 30 min，再用去离子水洗涤 3 次，冻干备用。
1.3 实验方法
1.3.1 冰冻切片制备及观察
将制备的 PU/SIS 复合材料在常温下置于 PBS，充分复水后浸泡 OCT 包埋剂，用眼科镊挤压材料，排除多孔材料内的空气，在材料恢复形状过程中 OCT 包埋剂可填充材料多孔空隙，反复数次，待无空气溢出后进行包埋，于–20℃ 行 6 μm 厚切片。大体观察切片完整性。
1.3.2 伊红染色及观察
将切片置于用 70% 乙醇配制的水溶性伊红染液（伊红浓度 1%）中染色 1 min，去离子水快速清洗切片上的多余染料。明场显微镜下观察复合材料上色效果及多孔结构。
1.3.3 封片分组及观察
根据封片方法不同，将染色后的切片随机分为 5 组。A 组：用甘油明胶直接湿封；B 组：切片经无水乙醇脱水后，TO 型生物透明剂透明，中性快干胶封片；C 组：切片经去离子水浸泡分色后风干，中性快干胶封片；D 组：切片经风干后，TO 型生物透明剂透明，中性快干胶封片；E 组：切片风干后直接用中性快干胶封片。将各组切片置于明场显微镜下观察复合材料组分分布情况。
2 结果
2.1 冰冻切片大体观察
实验制备的复合材料冰冻切片厚度均为 6 μm，大体观察见切片连续均匀，材料内部空隙被 OCT 包埋剂完全填充，切片内部无空洞出现，保持其完整性。见图 1。
图1
PU/SIS 复合材料 OCT 包埋、冰冻切片大体观察
a. PU/SIS 复合材料；b. OCT 浸泡；c. 制备冰冻切片；d. 裱片后材料连续完整
Figure1. Gross observation of PU/SIS which was OCT-embedded, sliced into sections by frozen section technologya. Composite of PU/SIS; b. OCT-embedded; c. Frozen section; d. Section was complete and continuous
2.2 伊红染色后明场显微镜观察
明场显微镜观察示，伊红染色 1 min 后，复合材料整体颜色鲜红，轮廓清晰，多孔结构清晰可见，但无法辨认复合材料两种组分的分布情况。见图 2。
图2
伊红染色后明场显微镜观察
从左至右分别为放大倍数 100、200、400 倍 a. 大孔径复合材料；b. 小孔径复合材料
Figure2. Brightfield microscopy observation after dyed with eosinFrom left to right for the amplification of 100, 200, and 400 times, respectively a. Large aperture composite materials; b. Small aperture composite materials
2.3 封片后分组观察
A 组：复合材料伊红整体动态褪色，直至灰色透明，最终两种组分无对比度。B 组：材料轮廓消失，PU 组分溶解变形。C 组：材料轮廓清晰完整，PU 与 SIS 两种组分同时出现褪色，但褪色程度无明显差异，能分辨两种组分分布，但有一定难度。D 组：材料轮廓清晰完整，SIS 颜色鲜红，PU 褪色至灰色透明，两者颜色对比度明显，能清晰显示组分分布情况。E 组：结果同 D 组一致。见图 3、4。
图3
各组大孔径复合材料封片后明场显微镜观察（×400）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure3. Brightfield microscopy observation of large aperture composite materials after sealing (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C;d. Group D; e. Group E
图4
各组小孔径复合材料封片后明场显微镜观察（×400）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure4. Brightfield microscopy observation of small aperture composite materials after sealing (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C;d. Group D; e. Group E
3 讨论
石蜡切片、冰冻切片、HE 染色是病理技术中的常规制片方法，在组织形态学评价方面具有重要作用[8-10]。此外，在组织工程领域，HE 染色还可用于观察材料的细胞相容性、组织相容性、降解及促进组织再生情况等[11-16]。但常用的石蜡切片方法对于部分合成材料，如本研究中采用的聚氨酯等，因温度和试剂性质的原因，常无法观察到完整的材料形态[7]。所以，本实验选择低温且不接触有机溶剂的冰冻切片方法，保护了复合材料中 PU 的结构完整性[17-19]。考虑到 PU/SIS 复合材料在常温和–20℃ 条件下具有弹性形变，我们在冰冻切片前对材料进行了预处理，即对材料进行复水和 OCT 浸润，使其在冰冻切片环境温度下保持较大的刚度，确保切片厚度准确。染色过程中，伊红采用低浓度乙醇配制，既可以保护 PU 不受破坏，又能使 SIS 颜色鲜红明亮，易与 PU 形成对比[20-21]。
在封片处理过程中，A 组是常规的水溶性封片法，但甘油和明胶配制的封片剂极易溶解水溶性较强的伊红染料，导致整个材料褪色至无色透明。B 组是常规的有机溶剂封片法，但无水乙醇在对切片脱水过程中溶解了 PU，导致材料形态结构被严重破坏。镜下观察发现，A 组伊红染料从 PU/SIS 复合材料上褪色的速度有所差异，PU 褪色速度比 SIS 稍快。所以 C 组拟利用伊红易溶于水的特性，将结合力有差别的两种组分进行分色[22]。但该方法对分色时间的要求较为严格，极难把控，同时由于 SIS 组分的褪色使其呈现淡红色，两组分对比度较差。
复合材料经伊红染色后观察到 PU 与 SIS 都呈现红色，说明两组分都被伊红染色。但在分色过程中又出现两组分褪色速度有所差异的现象，考虑伊红是否对两组分的染色原理有所不同。SIS 属于细胞外基质，大量的氨基基团在常温常压下很容易与带负电荷的伊红形成化学键[23-25]。PU 的侧链基团在常温常压下几乎没有与伊红形成化学键的可能，分析 PU 能被染色是由于材料空间结构的原因，物理性地吸附了伊红分子。同时又考虑到伊红难溶于强非极性的有机溶剂，并且 PU 含有大量的异氰酸酯键，具有耐受有机溶剂的特性。所以 D 组通过将切片置于 TO 有机溶剂中透明，与 SIS 结合的伊红不会溶于有机溶剂，但与 PU 结合的伊红在透明剂的作用下出现褪色，并且复合材料始终保持形态完好，镜下能观察到两组分具有较高的对比度。E 组采用以二甲苯等强非极性有机试剂为溶剂的中性快干胶进行封片，所以其染色效果与 D 组相近，是操作最为简便、耗时最短、染色效果最佳的制片方法。
综上述，本实验通过冰冻切片、伊红染色 1 min，风干后直接用中性快干胶封片的方法能对 PU/SIS 复合材料进行组分差异化染色。该方法有望应用于由高分子合成材料与细胞外基质材料制备的复合材料的组织学评价。
结合天然细胞外基质和高分子材料的优点，通过物理或化学的方法将这两类材料进行复合，制备更符合临床需求的复合材料，是目前组织工程支架材料的研究热点[1-3]。这类复合材料已用作食管、神经、腹壁以及心室壁等组织修复重建的支架材料，并取得较好的修复效果[4-6]。我们在前期研究中制备了具有多孔结构的聚氨酯-小肠黏膜下层（polyurethane/small intestinal submucosa，PU/SIS）复合材料，并证实其兼具合成材料和生物源性材料的优点，既具有优异的回弹性能、降解性能，还具有良好的细胞相容性和组织相容性，并能在一定程度上促进血管新生，在组织工程领域具有广阔的应用前景[7]。在实验研究中我们发现，传统的病理制片方法不仅会对高分子合成材料的形态结构造成溶解和破坏，而且无法用于观察复合材料两种组分的分布情况。而复合材料中各组分的分布情况对其质量控制以及治疗效果有重要意义，寻找一种可行的病理制片方法对这类复合材料进行表征具有重要意义。我们结合前期的制片经验，摸索出一套简便快捷的制片方法，该方法不仅可用于观察复合材料中细胞外基质成分的分布情况，还有望应用于其他含有高分子合成材料的复合材料的组织学评价。报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验材料及主要试剂、仪器
伊红（MERCK 公司，德国）；无水乙醇（成都科隆化学品有限公司）；TO 型生物透明剂（广西岑溪市天兴林化有限公司）；中性快干胶（无锡市江原实业技贸总公司）；OCT 冰冻切片包埋剂（Tissue-Tek 公司，美国）。冰冻切片机（Leica 公司，德国）；明场显微镜（ZEISS 公司，德国）。
1.2 PU/SIS 复合材料的制备
按照文献［7］方法制备复合材料，具体如下：① 将猪小肠清洗干净，分离 SIS。经脱脂、脱细胞和低温粉碎后，过 200 目筛，消毒灭菌备用。② 将聚四氢呋喃 1000（33.33 g，33.33 mmol）、异佛尔酮二异氰酸酯（21.48 g，96.67 mmol）和辛酸亚锡（0.02 mL）加入三口烧瓶中，于 74℃ 油浴锅中反应 3 h。加入 2，2-二羟甲基丁酸（4.94 g，33.33 mmol）于 54℃ 下反应 3 h。为使反应平稳进行，必要时可使用丙酮调节体系黏度。加入三乙胺（7 mL），在室温下搅拌 20 min。将反应产物缓慢滴加至丙酮水溶液（丙酮∶去离子水=1∶4）中，以1 300 r/min 搅拌 2 h 得到 PU 乳液。③ 将 0.3 g SIS 粉末加入至 10 g 固含量为 21% 的 PU 乳液中，搅拌 2.5 h。将制备的共混体系倒入模具中，于–80℃低温冰箱中预冻后，冷冻干燥 24 h。将上述材料浸泡在 1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐/N-羟基琥珀酰亚胺溶液中，37℃ 下避光反应 36 h。PBS 洗涤 5 次，每次 30 min，再用去离子水洗涤 3 次，冻干备用。
1.3 实验方法
1.3.1 冰冻切片制备及观察
将制备的 PU/SIS 复合材料在常温下置于 PBS，充分复水后浸泡 OCT 包埋剂，用眼科镊挤压材料，排除多孔材料内的空气，在材料恢复形状过程中 OCT 包埋剂可填充材料多孔空隙，反复数次，待无空气溢出后进行包埋，于–20℃ 行 6 μm 厚切片。大体观察切片完整性。
1.3.2 伊红染色及观察
将切片置于用 70% 乙醇配制的水溶性伊红染液（伊红浓度 1%）中染色 1 min，去离子水快速清洗切片上的多余染料。明场显微镜下观察复合材料上色效果及多孔结构。
1.3.3 封片分组及观察
根据封片方法不同，将染色后的切片随机分为 5 组。A 组：用甘油明胶直接湿封；B 组：切片经无水乙醇脱水后，TO 型生物透明剂透明，中性快干胶封片；C 组：切片经去离子水浸泡分色后风干，中性快干胶封片；D 组：切片经风干后，TO 型生物透明剂透明，中性快干胶封片；E 组：切片风干后直接用中性快干胶封片。将各组切片置于明场显微镜下观察复合材料组分分布情况。
2 结果
2.1 冰冻切片大体观察
实验制备的复合材料冰冻切片厚度均为 6 μm，大体观察见切片连续均匀，材料内部空隙被 OCT 包埋剂完全填充，切片内部无空洞出现，保持其完整性。见图 1。
图1
PU/SIS 复合材料 OCT 包埋、冰冻切片大体观察
a. PU/SIS 复合材料；b. OCT 浸泡；c. 制备冰冻切片；d. 裱片后材料连续完整
Figure1. Gross observation of PU/SIS which was OCT-embedded, sliced into sections by frozen section technologya. Composite of PU/SIS; b. OCT-embedded; c. Frozen section; d. Section was complete and continuous
2.2 伊红染色后明场显微镜观察
明场显微镜观察示，伊红染色 1 min 后，复合材料整体颜色鲜红，轮廓清晰，多孔结构清晰可见，但无法辨认复合材料两种组分的分布情况。见图 2。
图2
伊红染色后明场显微镜观察
从左至右分别为放大倍数 100、200、400 倍 a. 大孔径复合材料；b. 小孔径复合材料
Figure2. Brightfield microscopy observation after dyed with eosinFrom left to right for the amplification of 100, 200, and 400 times, respectively a. Large aperture composite materials; b. Small aperture composite materials
2.3 封片后分组观察
A 组：复合材料伊红整体动态褪色，直至灰色透明，最终两种组分无对比度。B 组：材料轮廓消失，PU 组分溶解变形。C 组：材料轮廓清晰完整，PU 与 SIS 两种组分同时出现褪色，但褪色程度无明显差异，能分辨两种组分分布，但有一定难度。D 组：材料轮廓清晰完整，SIS 颜色鲜红，PU 褪色至灰色透明，两者颜色对比度明显，能清晰显示组分分布情况。E 组：结果同 D 组一致。见图 3、4。
图3
各组大孔径复合材料封片后明场显微镜观察（×400）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure3. Brightfield microscopy observation of large aperture composite materials after sealing (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C;d. Group D; e. Group E
图4
各组小孔径复合材料封片后明场显微镜观察（×400）
a. A 组；b. B 组；c. C 组；d. D 组；e. E 组
Figure4. Brightfield microscopy observation of small aperture composite materials after sealing (×400)a. Group A; b. Group B; c. Group C;d. Group D; e. Group E
3 讨论
石蜡切片、冰冻切片、HE 染色是病理技术中的常规制片方法，在组织形态学评价方面具有重要作用[8-10]。此外，在组织工程领域，HE 染色还可用于观察材料的细胞相容性、组织相容性、降解及促进组织再生情况等[11-16]。但常用的石蜡切片方法对于部分合成材料，如本研究中采用的聚氨酯等，因温度和试剂性质的原因，常无法观察到完整的材料形态[7]。所以，本实验选择低温且不接触有机溶剂的冰冻切片方法，保护了复合材料中 PU 的结构完整性[17-19]。考虑到 PU/SIS 复合材料在常温和–20℃ 条件下具有弹性形变，我们在冰冻切片前对材料进行了预处理，即对材料进行复水和 OCT 浸润，使其在冰冻切片环境温度下保持较大的刚度，确保切片厚度准确。染色过程中，伊红采用低浓度乙醇配制，既可以保护 PU 不受破坏，又能使 SIS 颜色鲜红明亮，易与 PU 形成对比[20-21]。
在封片处理过程中，A 组是常规的水溶性封片法，但甘油和明胶配制的封片剂极易溶解水溶性较强的伊红染料，导致整个材料褪色至无色透明。B 组是常规的有机溶剂封片法，但无水乙醇在对切片脱水过程中溶解了 PU，导致材料形态结构被严重破坏。镜下观察发现，A 组伊红染料从 PU/SIS 复合材料上褪色的速度有所差异，PU 褪色速度比 SIS 稍快。所以 C 组拟利用伊红易溶于水的特性，将结合力有差别的两种组分进行分色[22]。但该方法对分色时间的要求较为严格，极难把控，同时由于 SIS 组分的褪色使其呈现淡红色，两组分对比度较差。
复合材料经伊红染色后观察到 PU 与 SIS 都呈现红色，说明两组分都被伊红染色。但在分色过程中又出现两组分褪色速度有所差异的现象，考虑伊红是否对两组分的染色原理有所不同。SIS 属于细胞外基质，大量的氨基基团在常温常压下很容易与带负电荷的伊红形成化学键[23-25]。PU 的侧链基团在常温常压下几乎没有与伊红形成化学键的可能，分析 PU 能被染色是由于材料空间结构的原因，物理性地吸附了伊红分子。同时又考虑到伊红难溶于强非极性的有机溶剂，并且 PU 含有大量的异氰酸酯键，具有耐受有机溶剂的特性。所以 D 组通过将切片置于 TO 有机溶剂中透明，与 SIS 结合的伊红不会溶于有机溶剂，但与 PU 结合的伊红在透明剂的作用下出现褪色，并且复合材料始终保持形态完好，镜下能观察到两组分具有较高的对比度。E 组采用以二甲苯等强非极性有机试剂为溶剂的中性快干胶进行封片，所以其染色效果与 D 组相近，是操作最为简便、耗时最短、染色效果最佳的制片方法。
综上述，本实验通过冰冻切片、伊红染色 1 min，风干后直接用中性快干胶封片的方法能对 PU/SIS 复合材料进行组分差异化染色。该方法有望应用于由高分子合成材料与细胞外基质材料制备的复合材料的组织学评价。
