骨组织工程支架材料需具有大尺寸、高连通孔结构，以促进物质交换以及细胞迁移[1-4]。而以墨鱼骨为基底制备的墨鱼骨转化羟基磷灰石多孔陶瓷（cuttlefish bone transformed hydroxyapatite，CB-HA）不仅具有大尺寸、高连通孔结构，还具有羟基磷灰石优异的生物相容性，能够满足骨组织工程材料结构和成分的要求[5-8]。然而细胞在 CB-HA 上的成骨基因表达不够理想，有待进一步提高[9-10]。有研究表明，通过在材料表面引入纳米结构，提高材料比表面积，能明显增强材料对多种蛋白（如免疫球蛋白、玻璃体结合蛋白等）的吸附能力，进而提高细胞黏附、增殖以及成骨基因表达的能力[11]。但是目前有关调控 CB-HA 表面纳米结构，探究其生物学性能的研究报道较少。为此，我们进行了本次实验，旨在探讨调控 CB-HA 表面纳米结构的方法，分析 CB-HA 表面纳米结构以及结构尺寸对成骨细胞黏附、增殖及 ALP 表达的影响。报告如下。
1 材料与方法
1.1 主要试剂与仪器
市售墨鱼骨。MC3T3-E1 小鼠成骨细胞（中国科学院上海生命科学研究院）。NaClO、NH4Cl、Na2HPO4、六甲基二硅氮烷（分析纯）、戊二醛［中国医药（集团）上海化学试剂公司］；MEM-α 培养基（GIBCO 公司，美国）；FBS（HyClone 公司，美国）；MTT 试剂盒（AMRESO 公司，美国）；0.25% 胰蛋白酶、pNPP 试剂盒（Sigma 公司，美国）；蛋白总量测试试剂盒（BioRad 公司，美国）。
X 射线衍射仪（Bruker 公司，德国）；380FT-IR 型傅里叶红外光谱仪（Nicolet 公司，美国）；715-ES 型电感耦合等离子体原子发射光谱（VARIAN 公司，美国）；S-4800 扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；ET-320VP 孔隙率测试仪（北京仪特诺电子科技有限公司）；TRISTAR3000 比表面测试仪（Micromeritics 公司，美国）；EPOCH 酶标仪（BioTek 公司，美国）。
1.2 不同纳米结构 CB-HA 的制备
将墨鱼骨切割成直径 10 mm、厚 2 mm 的圆片，置于去离子水中，在室温下抽真空 1 h 使水充分注入墨鱼骨后，转至 1 mol/L NaClO 溶液中，室温下放置 24 h 以去除材料表面有机成分。取出墨鱼骨片，去离子水清洗 3 次，于去离子水中保存，备用。
根据处理条件不同，实验分为 4 组。每组各取 4 g 制备的注水墨鱼骨片与 15 mL 不同浓度磷源溶液（表 1）充分混合，置于水热釜，放入烘箱于 120℃ 反应 24 h 后取出。取出后，组 1～3 材料清洗、烘干备用；组 4 进一步将材料置于管式炉中，于 1 200℃ 下烧结 3 h，去除其表面结构作为对照。
表1
CB-HA 转化条件
Table1.
Reaction conditions of CB-HA
1.3 不同纳米结构 CB-HA 物理化学性质表征
① 使用 X 射线衍射仪、傅里叶红外光谱仪测试各组 CB-HA 的 X 射线衍射光谱、红外线吸收光谱。② 将各组 CB-HA 研磨成粉末后浓盐酸溶解稀释，用电感耦合等离子体原子发射光谱分析其钙磷比，计算转换率。③ 扫描电镜观察各组 CB-HA 大孔结构及表面微纳米结构。④ 使用孔隙率测试仪测试各组 CB-HA 孔隙率，使用比表面测试仪测试 CB-HA 比表面积以及孔径分布。实验重复 3 次。
1.4 不同纳米结构 CB-HA 对成骨细胞的影响
1.4.1 细胞培养
取 MC3T3-E1 细胞系，加入完全培养液（含 10%FBS 的 MEM-α 培养基），置于 37℃、5%CO2 及 95% 饱和湿度的恒温培养箱中培养，隔天换液。待细胞生长至 80%～90% 汇合度时，弃培养液，PBS 清洗 2～3 次，37℃、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化 1～3 min；加入完全培养液终止反应，用移液器反复吹打若干次。室温下，以离心半径 10 cm，1 200 r/min 离心 5 min，弃上清液后加入完全培养液重悬细胞，按 1∶4 比例进行传代。
将各组 CB-HA 置于 48 孔板内，每孔 1 片。取第 4 代 MC3T3-E1 细胞接种于 CB-HA 上，每孔 8×103个细胞。置于 37℃、5%CO2 及 95% 饱和湿度的恒温培养箱中培养，隔天换液。
1.4.2 细胞黏附观察
培养 1 d，取出各组 CB-HA 置于 2.5% 戊二醛中，于 4℃ 冰箱中固定细胞 30 min，PBS 清洗 CB-HA 2 次，然后梯度脱水，分别用 30%、50%、70%、95%、100% 乙醇各脱水 5 min。最后六甲基二硅氮烷干燥、喷金，扫描电镜观察细胞形貌。
1.4.3 细胞增殖观察
培养 1、3、7 d，采用 MTT 法分析细胞增殖情况。操作如下：在细胞培养液中加入 0.5 mg/mL MTT 染料孵化 4 h，然后加入 300 μL DMSO 反应 1 h，最后采用酶标仪于波长 490 nm 处测量吸光度（A）值，以实际测量值与空白板测量值的差值作为最终结果。实验重复 3 次。
1.4.4 细胞 ALP 表达观察
培养 7、14 d，通过 pNPP 法测试细胞 ALP 表达。操作如下：首先利用 0.2%（V/V）Triton-X/EDTA 裂解细胞，将细胞溶解物高速离心（离心半径 6 cm，12 000 r/min 离心 5 min），然后取 100 μL 上清液和 200 μL pNPP 工作液在 37℃ 下反应 30 min，通过酶标仪在波长 405 nm 处测量 A 值。实验重复 3 次。
1.5 统计学方法
采用 SPSS 20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准 α=0.05。
2 结果
2.1 不同纳米结构 CB-HA 物理化学性质表征
2.1.1 化学成分分析
X 射线衍射光谱显示 4 组 CB-HA 均见羟基磷灰石的峰形，其中组 3、组 4 的结晶度更高。见图 1a。红外线吸收光谱显示 4 组 CB-HA 的红外吸收峰与羟基磷灰石一致；与组 1～3 相比，组 4 CB-HA 缺少 3 000～3 600 cm–1的水峰。见图 1b。电感耦合等离子体原子发射光谱分析显示，组 1～4 的 CB-HA 钙磷比分为 1.76、1.72、1.73、1.68，转换率分别为 94.9%、97.0%、96.5%、99.4%。
图1
CB-HA 化学成分分析
a. X 射线衍射光谱；b. 红外线吸收光谱
Figure1. Chemical composition analysis of CB-HAa. X-ray diffraction spectrum; b. Infrared absorption spectrum
2.1.2 物理性质分析
扫描电镜观察见，组 1 为大尺寸团簇结构，为厚度约 60 nm 的纳米片组成的直径约 3 μm 的团簇结构（图 2a）；组 2 为中尺寸团簇结构，为厚度约 15 nm 的纳米片组成的直径约 2.5 μm 的团簇结构（图 2b）；组 3 为小尺寸团簇结构，为厚度约 15 nm 的纳米片组成的直径约 2 μm 的团簇结构（图 2c）；组 4 表面没有明显纳米结构（图 2d）。
图2
CB-HA 扫描电镜观察
从左至右分别为放大 50、3 000、30 k 倍图片 a. 组 1；b. 组 2；c.组 3；d. 组 4
Figure2. Morphological analysis of CB-HA by scanning electron microscopyFrom left to right for the magnifications of 50, 3 000, and 30 k times, respectively a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4
组 1～4 CB-HA 的孔隙率分别为 95.3%±0.3%、94.9%±0.4%、95.1%±0.3%、95.5%±0.3%，组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；比表面积为（23.1±0.2）、（30.3±0.6）、（34.1±0.4）、（8.2±0.1）m2/g，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。孔径分布观察，与组 4 表面没有明显纳米结构的 CB-HA 相比，组 1～3 具有表面团簇结构的 CB-HA 具有更多的孔径<50 nm 微孔，并且随着纳米团簇结构尺寸的减小，表面微孔逐渐增多。
2.2 不同纳米结构 CB-HA 对成骨细胞的影响
2.2.1 细胞黏附观察
培养 1 d 后扫描电镜观察见，在各组具有不同纳米结构的 CB-HA 表面，MC3T3-E1 细胞伸展姿态不同。与组 1 以及组 4 相比，组 2 以及组 3 CB-HA 表面的 MC3T3-E1 细胞伸展出了更多丝状伪足，细胞也有更好的伸展状态。见图 3。
图3
培养 1 d 后扫描电镜观察 CB-HA 表面细胞形态
从左至右分别为放大 1.5 k、3 k、6 k 倍图片 a. 组 1；b. 组 2；c.组 3；d. 组 4
Figure3. Morphological analysis of cells on CB-HA by scanning electron microscopyFrom left to right for the magnifications of 1.5 k, 3 k, and 6 k times, respectively a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4
2.2.2 细胞增殖观察
培养 1、3 d，各组未见细胞明显增殖，组间 A 值比较差异无统计学意义（P>0.05）。7 d 时，各组均表现出更好的增殖情况；其中，组 2 及组 3A 值明显高于组 1 及组 4，差异有统计学意义（P<0.05）；组 2 及组 3 间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。
图4
MTT 检测培养1、3、7 d 细胞增殖曲线
Figure4.
Cell proliferation evaluated by MTT assay after 1, 3, and 7 days of co-culture
2.2.3 细胞 ALP 表达
培养 7 d，组 1～4 MC3T3-E1 细胞 ALP 表达分别为 28.17±0.37、30.94±1.15、39.35±2.15、8.91±0.32，14 d 时分别为 40.19±4.14、61.27±3.10、66.99±4.01、23.13±2.70；各时间点组 3 的 ALP 表达显著高于组 1、2、4，组 1、2 高于组 4，比较差异有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
大量研究表明，在材料表面引入纳米结构，能够显著提高材料的比表面积；而更大的比表面积能够提高材料对周围环境中离子、蛋白的吸附能力，从而促进细胞在材料表面的黏附、增殖以及成骨基因表达[11-14]。因此，本研究通过改变 CB-HA 表面纳米结构的尺寸，旨在筛选更适合 MC3T3-E1 细胞黏附、增殖以及促进 ALP 表达的 CB-HA 表面纳米结构。
材料制备与表征结果表明，随着转化溶液中铵根离子浓度的增加，CB-HA 表面的纳米团簇结构尺寸缩小、片状结构变薄，因此比表面积随之增加。其原因可能是羟基磷灰石晶体的 c 面富含磷酸根和羟基，因此带负电荷；其 a 面富含钙离子，因此带正电[15]。在羟基磷灰石生长体系中，某些离子、氨基酸能够吸附在羟基磷灰石特定晶面上，抑制羟基磷灰石特定晶面的生长，进而达到调控其表面结构的作用[16-19]。在本研究中可能是铵根离子与带负电荷的 c 面相结合，导致 c 面的生长被抑制，从而使 CB-HA 表面团簇结构越来越薄，整体尺寸也越来越小。并且，随着 CB-HA 表面团簇结构的减小，出现了更多孔径在 10 μm 以下的微孔，因此材料的比表面积也随之提高。
细胞实验表明，具有小尺寸团簇结构的 CB-HA 最有利于 MC3T3-E1 细胞黏附、增殖以及促进 ALP 表达，提示减小表面纳米结构的尺寸有利于细胞的黏附、增殖以及成骨分化。分析可能是因为随着纳米结构尺寸的减小，材料的比表面积增加，因此材料表面具有更多的蛋白吸附位点。前期研究已经证明，在共培养环境中，具有纳米结构的材料首先能够与周围环境相作用吸收环境中蛋白，如免疫球蛋白、玻璃体结合蛋白等[11-14, 20-22]，之后材料上吸附的蛋白能够与细胞膜表面的蛋白相结合，最终有利于细胞黏附、增殖。但是，具有纳米结构的 CB-HA 能否作为骨组织工程材料，还需要进一步体内研究。
综上述，通过控制转化溶液中铵根离子浓度，可以在 CB-HA 表面获得不同纳米团簇表面形貌的多孔陶瓷。具有小尺寸纳米团簇结构的 CB-HA 能更好地促进成骨细胞黏附、增殖以及 ALP 表达的能力，为后续 CB-HA 的应用研究提供了新的改性思路。
