墨鱼骨转化羟基磷灰石多孔陶瓷表面纳米结构调控及其对成骨细胞作用的研究_中国修复重建外科杂志

doi:10.7507/1002-1892.201804100

墨鱼骨转化羟基磷灰石多孔陶瓷表面纳米结构调控及其对成骨细胞作用的研究

敬林果 ¹ , 杨晨 ² , 郇志广 ² , 柯勤飞 ¹ , 常江 ^{2

,}

1. 上海师范大学生命与环境科学学院（上海　200234） ;
2. 中国科学院上海硅酸盐研究所高性能陶瓷和超微结构国家重点实验室生物医用材料与组织工程研究课题组（上海　200050）

收稿日期: 2018-04-25; 修回日期:2018-07-30;

基金项目: 国家自然科学基金资助项目（81430012）；上海市科学技术委员会资助项目（17540712300）

通讯作者: 常江, Email: jchang@mail.sic.ac.cn

Study on tailoring the nanostructured surfaces of cuttlefish bone transformed hydroxyapatite porous ceramics and its effect on osteoblasts

JING Linguo ¹ , YANG Chen ² , HUAN Zhiguang ² , KE Qinfei ¹ , CHANG Jiang ^{2

,}

1. College of Life and Environmental Sciences, Shanghai Normal University, Shanghai, 200234, P.R.China ;
2. Biomaterial and Tissue Engineering Research Center, State Key Laboratory of High Performance Ceramics and Superfine Microstructure, Shanghai Institute of Ceramics, Chinese Academy of Sciences, Shanghai, 200050, P.R.China

Corresponding Author: CHANG Jiang, Email: jchang@mail.sic.ac.cn

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目的探索墨鱼骨转化羟基磷灰石多孔陶瓷（cuttlefish bone transformed hydroxyapatite，CB-HA）表面纳米结构的制备与调控，以及不同尺寸纳米结构对成骨细胞黏附、增殖以及 ALP 表达的影响。方法取墨鱼骨制备成直径 10 mm、厚 2 mm 的注水骨片后分为 4 组，分别与不同浓度磷源溶液混合，置于水热釜，放入烘箱于 120℃ 反应 24 h 后，组 1～3 样品不作处理，组 4 进一步于 1 200℃ 下烧结 3 h，去除表面结构作为对照。采用 X 射线衍射仪、傅里叶红外光谱仪测试、电感耦合等离子体原子发射光谱分析各组 CB-HA 化学成分，扫描电镜、比表面测试仪、孔隙率测试仪分析其物理结构。取第 4 代 MC3T3-E1 细胞分别与 4 组 CB-HA 共培养，培养 1 d 后扫描电镜观察细胞形态，1、3、7 d 后用 MTT 法分析细胞增殖情况，7、14 d 后用 pNPP 法测试细胞 ALP 表达情况。结果 4 组 CB-HA X 射线衍射光谱均见羟基磷灰石的峰形，红外线吸收光谱示红外吸收峰与羟基磷灰石一致，电感耦合等离子体原子发射光谱分析显示钙磷比为 1.68～1.76。扫描电镜观察见组 1～3 CB-HA 表面分别为大、中、小尺寸团簇结构，组 4 表面没有明显纳米结构。4 组 CB-HA 比表面积比较差异有统计学意义（P<0.05），孔隙率比较差异无统计学意义（P>0.05）。与组 4 相比，组 1～3 孔径<50 nm 的微孔更多，并且随着纳米团簇结构尺寸的减小，微孔数量逐渐增多。与细胞共培养后，扫描电镜及 MTT 检测示，与组 1、4 相比，组 2、3 CB-HA 表面细胞黏附及增殖均更好，并且细胞有更多的 ALP 表达（P<0.05）。结论通过控制磷源溶液中铵根离子浓度能够调控 CB-HA 表面纳米团簇结构的尺寸，并且在 CB-HA 表面引入小尺寸团簇纳米结构能够改善材料的细胞黏附、增殖以及 ALP 表达，这种作用可能与纳米结构引起比表面积增加有关。

Objective To investigate the formation of nanostructure on cuttlefish bone transformed hydroxyapatite (CB-HA) porous ceramics and the effects of different nanostructures on the osteoblasts adhesion, proliferation, and alkaline phosphatase (ALP) expression. Methods The cuttlefish bone was shaped as plate with diameter of 10 mm and thickness of 2 mm, filled with water, and divided into 4 groups. The CB-HA in groups 1-4 were mixed with different phosphorous solutions and then placed in an oven at 120℃ for 24 hours. In addition, the samples in group 4 were further sintered at 1 200℃ for 3 hours to remove nanostructure as controls. The chemical composition of CB-HA were analyzed by X-ray diffraction spectroscopy, Fourier transform infrared spectrum, and inductively coupled plasma (ICP). The physical structure was analyzed using scanning electron microscopy, specific surface tester, and porosity tester. The MC3T3-E1 cells of 4th generation were co-cultured with 4 groups of CB-HA. After 1 day, the morphology of the cells was observed under scanning electron microscopy. After 1, 3, and 7 days, the cell proliferation was analyzed by MTT assay. After 7 and 14 days, the ALP expression was measured by pNPP method. Results X-ray diffraction spectrum showed that the four nanostructures of CB-HA were made of hydroxyapatite. The infrared absorption spectrum showed that the infrared absorption peak of CB-HA was consistent with hydroxyapatite. ICP showed that the ratio of calcium to phosphorus of all CB-HA was 1.68-1.76, which was consistent with hydroxyapatite. Scanning electron microscopy observation showed that the nanostructure on the surface of CB-HA in groups 1-3 were large, medium, and small cluster-like structures, respectively, and CB-HA in group 4 had no obvious nanostructure. There were significant differences in the specific surface areas between groups (P<0.05). There was no significant difference in the porosity between groups (P>0.05). Compared with group 4, groups 1-3 have more pores with pore size less than 50 nm. After co-cultured with osteoblasts, scanning electron microscopy observation and MTT assay showed that the cells on groups 2 and 3 adhered and proliferated better and had more ALP expression than that on groups 1 and 4 (P<0.05). Conclusion The size of cluster-like nanostructure on the surface of CB-HA can be controlled by adjusting the concentration of ammonium ions in the phosphorous solution, and the introduction of small-sized cluster-like nanostructure on the surface of CB-HA can significantly improve the cell adhesion, proliferation, and ALP expression of the material which might be resulted from the enlarged surface area.

关键词: 骨组织工程; 墨鱼骨; 羟基磷灰石; 多孔陶瓷; 纳米结构

Key words: Bone tissue engineering; cuttlefish bone; hydroxyapatite; porous ceramics; nanostructure

骨组织工程支架材料需具有大尺寸、高连通孔结构，以促进物质交换以及细胞迁移^[1-4]。而以墨鱼骨为基底制备的墨鱼骨转化羟基磷灰石多孔陶瓷（cuttlefish bone transformed hydroxyapatite，CB-HA）不仅具有大尺寸、高连通孔结构，还具有羟基磷灰石优异的生物相容性，能够满足骨组织工程材料结构和成分的要求^[5-8]。然而细胞在 CB-HA 上的成骨基因表达不够理想，有待进一步提高^[9-10]。有研究表明，通过在材料表面引入纳米结构，提高材料比表面积，能明显增强材料对多种蛋白（如免疫球蛋白、玻璃体结合蛋白等）的吸附能力，进而提高细胞黏附、增殖以及成骨基因表达的能力^[11]。但是目前有关调控 CB-HA 表面纳米结构，探究其生物学性能的研究报道较少。为此，我们进行了本次实验，旨在探讨调控 CB-HA 表面纳米结构的方法，分析 CB-HA 表面纳米结构以及结构尺寸对成骨细胞黏附、增殖及 ALP 表达的影响。报告如下。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

市售墨鱼骨。MC3T3-E1 小鼠成骨细胞（中国科学院上海生命科学研究院）。NaClO、NH₄Cl、Na₂HPO₄、六甲基二硅氮烷（分析纯）、戊二醛［中国医药（集团）上海化学试剂公司］；MEM-α 培养基（GIBCO 公司，美国）；FBS（HyClone 公司，美国）；MTT 试剂盒（AMRESO 公司，美国）；0.25% 胰蛋白酶、pNPP 试剂盒（Sigma 公司，美国）；蛋白总量测试试剂盒（BioRad 公司，美国）。

X 射线衍射仪（Bruker 公司，德国）；380FT-IR 型傅里叶红外光谱仪（Nicolet 公司，美国）；715-ES 型电感耦合等离子体原子发射光谱（VARIAN 公司，美国）；S-4800 扫描电镜（Hitachi 公司，日本）；ET-320VP 孔隙率测试仪（北京仪特诺电子科技有限公司）；TRISTAR3000 比表面测试仪（Micromeritics 公司，美国）；EPOCH 酶标仪（BioTek 公司，美国）。

1.2 不同纳米结构 CB-HA 的制备

将墨鱼骨切割成直径 10 mm、厚 2 mm 的圆片，置于去离子水中，在室温下抽真空 1 h 使水充分注入墨鱼骨后，转至 1 mol/L NaClO 溶液中，室温下放置 24 h 以去除材料表面有机成分。取出墨鱼骨片，去离子水清洗 3 次，于去离子水中保存，备用。

根据处理条件不同，实验分为 4 组。每组各取 4 g 制备的注水墨鱼骨片与 15 mL 不同浓度磷源溶液（表 1）充分混合，置于水热釜，放入烘箱于 120℃ 反应 24 h 后取出。取出后，组 1～3 材料清洗、烘干备用；组 4 进一步将材料置于管式炉中，于 1 200℃ 下烧结 3 h，去除其表面结构作为对照。

表1 CB-HA 转化条件 Table1. Reaction conditions of CB-HA

表选项

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组别 Group	转化液浓度 Concentration of reactant	转化条件 Reaction condition
1	0.4 mol/L Na₂HPO₄+0.1 mol/L NH₄Cl	120℃、24 h 水热
2	0.4 mol/L Na₂HPO₄+0.2 mol/L NH₄Cl	120℃、24 h 水热
3	0.4 mol/L Na₂HPO₄+0.4 mol/L NH₄Cl	120℃、24 h 水热
4	0.4 mol/L Na₂HPO₄+0.4 mol/L NH₄Cl	120℃、24 h 水热+1 200℃、3 h 烧结

1.3 不同纳米结构 CB-HA 物理化学性质表征

① 使用 X 射线衍射仪、傅里叶红外光谱仪测试各组 CB-HA 的 X 射线衍射光谱、红外线吸收光谱。② 将各组 CB-HA 研磨成粉末后浓盐酸溶解稀释，用电感耦合等离子体原子发射光谱分析其钙磷比，计算转换率。③ 扫描电镜观察各组 CB-HA 大孔结构及表面微纳米结构。④ 使用孔隙率测试仪测试各组 CB-HA 孔隙率，使用比表面测试仪测试 CB-HA 比表面积以及孔径分布。实验重复 3 次。

1.4 不同纳米结构 CB-HA 对成骨细胞的影响

1.4.1 细胞培养

取 MC3T3-E1 细胞系，加入完全培养液（含 10%FBS 的 MEM-α 培养基），置于 37℃、5%CO₂ 及 95% 饱和湿度的恒温培养箱中培养，隔天换液。待细胞生长至 80%～90% 汇合度时，弃培养液，PBS 清洗 2～3 次，37℃、0.25% 胰蛋白酶-0.02%EDTA 消化 1～3 min；加入完全培养液终止反应，用移液器反复吹打若干次。室温下，以离心半径 10 cm，1 200 r/min 离心 5 min，弃上清液后加入完全培养液重悬细胞，按 1∶4 比例进行传代。

将各组 CB-HA 置于 48 孔板内，每孔 1 片。取第 4 代 MC3T3-E1 细胞接种于 CB-HA 上，每孔 8×10³个细胞。置于 37℃、5%CO₂ 及 95% 饱和湿度的恒温培养箱中培养，隔天换液。

1.4.2 细胞黏附观察

培养 1 d，取出各组 CB-HA 置于 2.5% 戊二醛中，于 4℃ 冰箱中固定细胞 30 min，PBS 清洗 CB-HA 2 次，然后梯度脱水，分别用 30%、50%、70%、95%、100% 乙醇各脱水 5 min。最后六甲基二硅氮烷干燥、喷金，扫描电镜观察细胞形貌。

1.4.3 细胞增殖观察

培养 1、3、7 d，采用 MTT 法分析细胞增殖情况。操作如下：在细胞培养液中加入 0.5 mg/mL MTT 染料孵化 4 h，然后加入 300 μL DMSO 反应 1 h，最后采用酶标仪于波长 490 nm 处测量吸光度（A）值，以实际测量值与空白板测量值的差值作为最终结果。实验重复 3 次。

1.4.4 细胞 ALP 表达观察

培养 7、14 d，通过 pNPP 法测试细胞 ALP 表达。操作如下：首先利用 0.2%（V/V）Triton-X/EDTA 裂解细胞，将细胞溶解物高速离心（离心半径 6 cm，12 000 r/min 离心 5 min），然后取 100 μL 上清液和 200 μL pNPP 工作液在 37℃ 下反应 30 min，通过酶标仪在波长 405 nm 处测量 A 值。实验重复 3 次。

1.5 统计学方法

采用 SPSS 20.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用 LSD 法；检验水准 α=0.05。

2 结果

2.1 不同纳米结构 CB-HA 物理化学性质表征

2.1.1 化学成分分析

X 射线衍射光谱显示 4 组 CB-HA 均见羟基磷灰石的峰形，其中组 3、组 4 的结晶度更高。见图 1a。红外线吸收光谱显示 4 组 CB-HA 的红外吸收峰与羟基磷灰石一致；与组 1～3 相比，组 4 CB-HA 缺少 3 000～3 600 cm^–1的水峰。见图 1b。电感耦合等离子体原子发射光谱分析显示，组 1～4 的 CB-HA 钙磷比分为 1.76、1.72、1.73、1.68，转换率分别为 94.9%、97.0%、96.5%、99.4%。

图1 CB-HA 化学成分分析

a. X 射线衍射光谱；b. 红外线吸收光谱

Figure1. Chemical composition analysis of CB-HA

a. X-ray diffraction spectrum; b. Infrared absorption spectrum

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2.1.2 物理性质分析

扫描电镜观察见，组 1 为大尺寸团簇结构，为厚度约 60 nm 的纳米片组成的直径约 3 μm 的团簇结构（图 2a）；组 2 为中尺寸团簇结构，为厚度约 15 nm 的纳米片组成的直径约 2.5 μm 的团簇结构（图 2b）；组 3 为小尺寸团簇结构，为厚度约 15 nm 的纳米片组成的直径约 2 μm 的团簇结构（图 2c）；组 4 表面没有明显纳米结构（图 2d）。

图2 CB-HA 扫描电镜观察

从左至右分别为放大 50、3 000、30 k 倍图片　a. 组 1；b. 组 2；c.组 3；d. 组 4

Figure2. Morphological analysis of CB-HA by scanning electron microscopy

From left to right for the magnificantions of 50, 3 000, and 30 k times, respectively　a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4

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组 1～4 CB-HA 的孔隙率分别为 95.3%±0.3%、94.9%±0.4%、95.1%±0.3%、95.5%±0.3%，组间比较差异无统计学意义（P>0.05）；比表面积为（23.1±0.2）、（30.3±0.6）、（34.1±0.4）、（8.2±0.1）m²/g，组间比较差异均有统计学意义（P<0.05）。孔径分布观察，与组 4 表面没有明显纳米结构的 CB-HA 相比，组 1～3 具有表面团簇结构的 CB-HA 具有更多的孔径<50 nm 微孔，并且随着纳米团簇结构尺寸的减小，表面微孔逐渐增多。

2.2 不同纳米结构 CB-HA 对成骨细胞的影响

2.2.1 细胞黏附观察

培养 1 d 后扫描电镜观察见，在各组具有不同纳米结构的 CB-HA 表面，MC3T3-E1 细胞伸展姿态不同。与组 1 以及组 4 相比，组 2 以及组 3 CB-HA 表面的 MC3T3-E1 细胞伸展出了更多丝状伪足，细胞也有更好的伸展状态。见图 3。

图3 培养 1 d 后扫描电镜观察 CB-HA 表面细胞形态

从左至右分别为放大 1.5 k、3 k、6 k 倍图片　a. 组 1；b. 组 2；c.组 3；d. 组 4

Figure3. Morphological analysis of cells on CB-HA by scanning electron microscopy

From left to right for the magnificantions of 1.5 k, 3 k, and 6 k times, respectively　a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4

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2.2.2 细胞增殖观察

培养 1、3 d，各组未见细胞明显增殖，组间 A 值比较差异无统计学意义（P>0.05）。7 d 时，各组均表现出更好的增殖情况；其中，组 2 及组 3A 值明显高于组 1 及组 4，差异有统计学意义（P<0.05）；组 2 及组 3 间差异无统计学意义（P>0.05）。见图 4。

图4 MTT 检测培养1、3、7 d 细胞增殖曲线 Figure4. Cell proliferation evaluated by MTT assay after 1, 3, and 7 days of co-culture

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2.2.3 细胞 ALP 表达

培养 7 d，组 1～4 MC3T3-E1 细胞 ALP 表达分别为 28.17±0.37、30.94±1.15、39.35±2.15、8.91±0.32，14 d 时分别为 40.19±4.14、61.27±3.10、66.99±4.01、23.13±2.70；各时间点组 3 ALP 表达显著高于组 1、2、4，组 1、2 高于组 4，比较差异有统计学意义（P<0.05）。

3 讨论

大量研究表明，在材料表面引入纳米结构，能够显著提高材料的比表面积；而更大的比表面积能够提高材料对周围环境中离子、蛋白的吸附能力，从而促进细胞在材料表面的黏附、增殖以及成骨基因表达^[11-14]。因此，本研究通过改变 CB-HA 表面纳米结构的尺寸，旨在筛选更适合 MC3T3-E1 细胞黏附、增殖以及促进 ALP 表达的 CB-HA 表面纳米结构。

材料制备与表征结果表明，随着转化溶液中铵根离子浓度的增加，CB-HA 表面的纳米团簇结构尺寸缩小、片状结构变薄，因此比表面积随之增加。其原因可能是羟基磷灰石晶体的 c 面富含磷酸根和羟基，因此带负电荷；其 a 面富含钙离子，因此带正电^[15]。在羟基磷灰石生长体系中，某些离子、氨基酸能够吸附在羟基磷灰石特定晶面上，抑制羟基磷灰石特定晶面的生长，进而达到调控其表面结构的作用^[16-19]。在本研究中可能是铵根离子与带负电荷的 c 面相结合，导致 c 面的生长被抑制，从而使 CB-HA 表面团簇结构越来越薄，整体尺寸也越来越小。并且，随着 CB-HA 表面团簇结构的减小，出现了更多孔径在 10 μm 以下的微孔，因此材料的比表面积也随之提高。

细胞实验表明，具有小尺寸团簇结构的 CB-HA 最有利于 MC3T3-E1 细胞黏附、增殖以及促进 ALP 表达，提示减小表面纳米结构的尺寸有利于细胞的黏附、增殖以及成骨分化。分析可能是因为随着纳米结构尺寸的减小，材料的比表面积增加，因此材料表面具有更多的蛋白吸附位点。前期研究已经证明，在共培养环境中，具有纳米结构的材料首先能够与周围环境相作用吸收环境中蛋白，如免疫球蛋白、玻璃体结合蛋白等^{[11-14, 20-22]}，之后材料上吸附的蛋白能够与细胞膜表面的蛋白相结合，最终有利于细胞黏附、增殖。但是，具有纳米结构的 CB-HA 能否作为骨组织工程材料，还需要进一步体内研究。

综上述，通过控制转化溶液中铵根离子浓度，可以在 CB-HA 表面获得不同纳米团簇表面形貌的多孔陶瓷。具有小尺寸纳米团簇结构的 CB-HA 对于 MC3T3-E1 细胞能更好地促进成骨细胞黏附、增殖以及 ALP 表达的能力，为后续 CB-HA 的应用研究提供了新的改性思路。

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表1 CB-HA 转化条件
Table1. Reaction conditions of CB-HA

组别 Group	转化液浓度 Concentration of reactant	转化条件 Reaction condition
1	0.4 mol/L Na₂HPO₄+0.1 mol/L NH₄Cl	120℃、24 h 水热
2	0.4 mol/L Na₂HPO₄+0.2 mol/L NH₄Cl	120℃、24 h 水热
3	0.4 mol/L Na₂HPO₄+0.4 mol/L NH₄Cl	120℃、24 h 水热
4	0.4 mol/L Na₂HPO₄+0.4 mol/L NH₄Cl	120℃、24 h 水热+1 200℃、3 h 烧结

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图1 CB-HA 化学成分分析

Figure1. Chemical composition analysis of CB-HA

a. X-ray diffraction spectrum; b. Infrared absorption spectrum

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图2 CB-HA 扫描电镜观察

Figure2. Morphological analysis of CB-HA by scanning electron microscopy

From left to right for the magnificantions of 50, 3 000, and 30 k times, respectively　a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4

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图3 培养 1 d 后扫描电镜观察 CB-HA 表面细胞形态

Figure3. Morphological analysis of cells on CB-HA by scanning electron microscopy

From left to right for the magnificantions of 1.5 k, 3 k, and 6 k times, respectively　a. Group 1; b. Group 2; c. Group 3; d. Group 4

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图4 MTT 检测培养1、3、7 d 细胞增殖曲线

Figure4. Cell proliferation evaluated by MTT assay after 1, 3, and 7 days of co-culture

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