骨重建是骨吸收与骨形成的偶合过程^[1]，在破骨细胞吸收以及成骨细胞形成的过程中伴随着偶联机制的发生 ^[2-3]。骨重建过程的分子偶联机制一直是研究热点，而 Eph-Ephrin 双向信号通路的发现解释了骨重建这一偶合过程。目前研究已经发现 Eph 家族的受体酪氨酸激酶，包括 A 和 B 两大亚族，涉及到各种细胞和器官中的生理和病理过程^[4-5]。有研究证实 Eph-Ephrin 双向信号通路参与了血管、骨组织发育和轴突导向等生理过程^[6-10]，而在骨组织中该双向信号通路受哪些因素影响尚未明确。

FTY720 是通过在中药冬虫夏草抽提物多球壳菌素的羟链上引入苯环和羟烷基获得的一种新型药物^[11]，在生物体内 FTY720 可被鞘氨醇激酶磷酸化为具有生物活性的 FTY720-P^[12]。研究表明，FTY720 通过抑制炎性因子的表达，进而抑制破骨细胞功能，发挥促进骨形成的作用^[13]。本课题组前期实验也证明 FTY720-P 能够抑制破骨细胞的分化^[14]，并具有促进原代成骨细胞外基质成熟的作用^[15]，但是 FTY720-P 是否对破骨细胞上 EphA2-EphrinA2 这一重要的双向信号通路及其下游蛋白 RhoA 产生作用尚未明确。为此，本次研究中我们采用地塞米松及1α，25-二羟维生素D₃诱导小鼠巨噬细胞 RAW 264.7 为破骨细胞后，观察 FTY720-P 对 EphA2-EphrinA2 双向信号通路的潜在影响，为明确该药物在破骨细胞中发挥效应的具体作用机制作奠定基础。

1   材料与方法

1.1   主要试剂及仪器

小鼠巨噬细胞 RAW264.7（美国 ATCC 细胞库）；α-MEM（HyClone 公司，美国）；FBS（杭州四季青生物工程材料有限公司）； FTY720-P（Cayman 公司，美国）；地塞米松、1α，25-二羟维生素D₃（Sigma 公司，美国）；兔来源 BMP-2 抗体、兔来源 TGF-β₁ 抗体、兔来源 EphA2 抗体、兔来源 EphrinA2 抗体、兔来源 RhoA 抗体（武汉博士德生物工程有限公司）；抗酒石酸酸性磷酸酶（tartrate resistant acid phosphatase，TRAP）试剂盒（南京建成生物工程研究所）；BCA 蛋白定量检测试剂盒（江苏碧云天生物技术研究所）；ECL 发光液（南京凯基生物技术股份有限公司）； M-MLV 逆转录酶（TaKaRa 公司，日本）；Trizol（Invitrogen 公司，美国）。倒置相差显微镜（Leica 公司，德国）；荧光显微镜（Nikon 公司，日本）。

1.2   实验分组及方法

取 RAW264.7 细胞置于 25 mL 培养瓶中，采用含 20%FBS、100 U/mL 青霉素和链霉素的 α-MEM 培养基，于 37℃、5% CO₂ 培养箱培养；第 2 天更换培养液。待细胞复苏并长满瓶底后，采用 0.25% 胰蛋白酶消化，按 1∶3 比例传代，取第 3 代细胞进行观察。采用 0.25% 胰蛋白酶消化后，轻轻吸出细胞，分别接种至 6 孔板（1×10⁵个/孔）及 12 孔板（5×10⁴个/孔）。细胞完全贴壁后，6 孔板及 12 孔板每孔分别加入 2 mL 和 1 mL 破骨细胞诱导液，含 10%FBS、100 U/mL 青霉素和链霉素、1×10^–7mol/L 地塞米松、1×10^–8mol/L 1α，25-二羟维生素D₃ 的 α-MEM 培养基；隔天换液，诱导期间倒置相差显微镜观察细胞形态。诱导培养 5 d 后，取细胞采用 TRAP 染色鉴定是否诱导分化为破骨细胞。

根据不同处理方法，将诱导成功后的破骨细胞分为两组。两组均加入含 10%FBS、100 U/mL 青霉素和链霉素的 α-MEM 培养基，实验组另加入 400 ng /mL FTY720-P（以氯仿为溶解剂）、对照组培养基中仅加入溶解剂。置于 37℃、5% CO₂ 培养箱培养 48 h 后进行观测。

1.3   观测指标

1.3.1   实时荧光定量 PCR 检测

取两组细胞，Trizol 提取总 RNA，然后按 M-MLV 逆转录酶试剂说明书进行逆转录。以 GAPDH 作为内参，反应条件：95℃、1 min；95℃、10 s，59℃、20 s，45 个循环；60～95℃ 进行溶解曲线分析。检测各基因 Ct 值，设 3 个复孔。利用 2^–△△Ct计算各目的基因相对表达量。目的基因引物序列见表 1。

表1 目的基因引物序列 Table1. Primer sequences of targeted genes

表选项

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1.3.2   Western blot检测

取两组细胞，采用 BCA 蛋白定量检测试剂盒进行组织蛋白定量。用 30 mg 蛋白溶解于 SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳后，转移到硝酸纤维素膜上。转膜结束后，放入 5% 脱脂奶粉，常温孵育 2 h。封闭结束后，PBST 洗膜 3 次，每次 5 min。按照 1∶1 000 比例稀释浓度分别加入兔来源 EphA2 抗体、兔来源 EphrinA2 抗体、兔来源 RhoA 抗体，常温孵育 2 h。一抗孵育结束，PBST 洗 5 次，每次间隔 5 min，加入 HRP 标记的二抗（1∶2 500 比例稀释），常温孵育 1 h，ECL 发光液检测需要测定的蛋白信号。实验重复 3 次，用 Image J 软件计算目的蛋白相对表达量。

1.3.3   免疫荧光染色观察

免疫荧光染色检测 BMP-2 及 TGF-β₁ 蛋白表达。两组各取 2 孔细胞，吸去细胞上清，PBS 洗 1 次，4% 多聚甲醛固定细胞 20 min，PBS 洗 3 次、每次 5 min，75% 乙醇浸泡细胞，4℃ 保存过夜；第 2 天 PBS 洗 1 次、3 min，加入 0.5%TritonX-100、20 min，吸去液体，PBS 洗 2 次、每次 3 min，加入 3%BSA，37℃ 下静置 30 min，吸去液体。分别加入 100 μL 稀释后的抗体，37℃ 下避光保存 1 h，PBS 洗 3 次、每次 5 min；依次加入 75%、85%、100% 乙醇脱水各 1 min，干燥后加入 10 μL DAPI，封片，10 min 后荧光显微镜下观察，见细胞质中高亮红色颗粒为阳性表达。

1.4   统计学方法

采用 SPSS22.0 统计软件进行分析。数据以均数±标准差表示，组间比较采用独立样本 t 检验；检验水准 α=0.05。

2   结果

2.1   细胞形态观察及鉴定

倒置相差显微镜下观察，未经诱导的 RAW264.7 细胞呈圆形或椭圆形，少数存在伪足，细胞体积较小，一般含有 1～2 个细胞核（图 1a）。经破骨细胞诱导液诱导 2 d 后，细胞体积开始增大，由类圆形逐渐发展为长条状或多边形状，细胞核多、界限不清，较模糊，可见多核细胞（图 1b）；诱导 5 d 后，可见大量具有典型破骨细胞特征的细胞，即细胞胞体较大，呈油煎蛋型、长条形、漏斗形或不规则形等，有伪足和丝状突起，细胞胞质内可见大小不等空泡（图 1c），典型的破骨细胞中含 2～20 个细胞核（图 1d）。TRAP 染色鉴定均为阳性细胞，即酶活性部位呈酒红色或橙红色，分布于细胞胞质内，细胞核为深蓝色或空泡状（图 1e），提示诱导培养成功。

图1 细胞培养观察

a. 未经诱导的 RAW264.7 细胞形态（倒置相差显微镜×40）；b. 诱导培养 2 d 后细胞形态（倒置相差显微镜×100）；c. 诱导培养 5 d 后细胞形态（倒置相差显微镜×200）；d. 诱导培养 5 d 后典型破骨细胞形态（倒置相差显微镜×400）；e. 诱导培养 5 d 后 TRAP 染色（荧光显微镜×400）

Figure1. Observation of cell culture

a. Morphology of RAW264.7 macrophages before induced (Inverted phase contrast microscope×40); b. Cellular morphology after induced for 2 days (Inverted phase contrast microscope×100); c. Cellular morphology after induced for 5 days (Inverted phase contrast microscope×200); d. Typical morphology of osteoclasts after induced for 5 days (Inverted phase contrast microscope×400); e. TRAP staining after induced for 5 days (Fluorescence microscope ×400)

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2.2   实时荧光定量 PCR 检测

实验组 EphA2 及 EphrinA2 mRNA 相对表达量分别为 0.148±0.015、0.086±0.005，对照组分别为 1.001±0.059、1.002±0.137。与对照组相比，实验组 EphA2 及 EphrinA2 mRNA 相对表达量明显降低，比较差异均有统计学意义（t=27.130，P=0.001；t=11.850，P=0.007）。

实验组 BMP-2 及 TGF-β₁ 相对表达量分别为 1.858±0.442、1.536±0.074，对照组分别为 0.851±0.191、0.950±0.171。与对照组相比，实验组 BMP-2 及 TGF-β₁ mRNA 相对表达量明显增高，比较差异均有统计学意义（t=5.001，P=0.037；t=5.102，P=0.036）。

2.3   Western blot 检测

实验组 EphA2、EphrinA2 和 RhoA 蛋白相对表达量分别为 1.06±0.01、1.18±0.08、1.01±0.04，对照组分别为 1.15±0.04、1.38±0.06、1.27±0.10。与对照组相比，实验组 EphA2、EphrinA2 和 RhoA 蛋白相对表达量均显著下降，比较差异均有统计学意义（t=5.029，P=0.037；t=4.949，P=0.038；t=4.382，P=0.048）。见图 2。

图2 Western blot 检测两组 EphA2、EphrinA2 和 RhoA 蛋白表达

1：对照组　2：实验组

Figure2. Expressions of EphA2, EphrinA2, and RhoA proteins in2 groups by Western blot detection

1: Control group 2: Experimental group

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2.4   免疫荧光染色观察

对照组 BMP-2 和 TGF-β₁免疫荧光染色呈弱阳性反应，可见少量细胞胞质中有散在、高亮红色颗粒。而实验组 BMP-2 和 TGF-β₁ 荧光染色均显著增强，可见大量细胞胞质中有散在、高亮红色颗粒。见图 3、4。

图3 两组 BMP-2 免疫荧光染色观察（荧光显微镜×400）

从左至右分别为 DAPI 染色、BMP-2 染色、重叠图像　a. 对照组； b. 实验组

Figure3. BMP-2 immunofluorescence staining of 2 groups (Fluorescence microscope×400)

From left to right for DAPI staining, BMP-2 staining, and overlapping images, respectively　a. Control group; b. Experimental group

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图4 两组 TGF-β₁ 免疫荧光染色观察（荧光显微镜×400）

从左至右分别为 DAPI 染色、TGF-β₁ 染色、重叠图像　a. 对照组； b. 实验组

Figure4. TGF-β₁ immunofluorescence staining of 2 groups (Fluorescence microscope×400)

From left to right for DAPI staining, TGF-β₁ staining, and overlapping images, respectively　a. Control group; b. Experimental group

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3   讨论

骨重建中，破骨细胞和成骨细胞的平衡是维持骨稳定的关键，Eph 和 Ephrin 蛋白参与调节这一过程^[16]。EphA2-EphrinA2 的接触发生于破骨细胞分化的多个阶段，例如前体破骨细胞和成熟的破骨细胞，能导致早期前体破骨细胞的分化，加速细胞间的融合和功能的活化。与 EphA2 和 EphrinA2 在运动神经元中的拮抗作用相反，EphrinA2 的反向信号传导和 EphA2 的正向信号传导均能促进破骨细胞的分化^[17]。Diercke 等^[18]研究发现体外使用 EphrinA2 刺激牙槽骨成骨细胞能明显抑制成骨基因表达，同时抑制成骨分化，提示 Eph 受体/Ephrin 配体家族对骨组织的潜在作用。Irie 等^[1]报道，EphA2-EphrinA2 双向信号通路能通过上调 RhoA 的表达，来抑制成骨细胞分化、促进破骨细胞分化。为此，为了验证 FTY720-P 对破骨细胞上 EphA2-EphrinA2 双向信号通路及下游 RhoA 蛋白的影响，本研究将 FTY720-P 作用于诱导成功后的破骨细胞，利用 Western blot 和实时荧光定量 PCR 检测 EphA2、EphrinA2 和 RhoA 蛋白和基因表达变化。结果显示，实验组以上指标表达较对照组均明显减少，明确了 FTY720-P 对 EphA2-EphrinA2 双向信号通路及其下游 RhoA 蛋白表达的影响。

TGF-β₁ 与骨代谢密切相关，有研究表明 TGF-β₁ 不仅能促进成骨细胞的增殖、成熟，也能促进破骨细胞的凋亡，减轻破骨细胞的破骨作用，增加骨密度^[19-22]，而 BMP-2 是目前公认的骨生长诱导因子，能够诱导成骨细胞的分化并增强成骨细胞内 ALP 的活性^[23-24]。因此，本研究也观察了 FTY720-P 对 TGF-β₁ 以及 BMP-2 的影响。结果显示，实验组 FTY720-P 作用于破骨细胞 48 h 后，TGF-β₁ 和 BMP-2 蛋白表达增强及基因相对表达量明显升高。BMP-2 表达水平升高提示在骨重建过程中，FTY720-P 能够通过促进破骨细胞分泌 BMP-2，从而促进成骨细胞的分化成熟。而 TGF-β₁ 表达水平升高则表明破骨细胞的破骨作用得到抑制，同时成骨细胞的增殖、成熟能力增强。

综上述，本研究结果提示，FTY720-P 能通过影响破骨细胞 EphrinA2-EphA2 双向信号通路间的传导下调 RhoA，同时还能促进 TGF-β₁ 和 BMP-2 的表达，最终影响破骨细胞的破骨作用。但是，FTY720-P 除能够通过作用于 EphA2-EphrinA2 双向信号通路，从而影响破骨细胞的分化之外，能否影响成骨细胞的形成，本实验尚未进行深入探讨，有待后续实验研究。