• 1. 锦州医科大学附属第一医院骨科(辽宁锦州 121001);
  • 2. 锦州医科大学(辽宁锦州 121001);
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目的通过瞬时转染缺氧诱导因子 1α(hypoxia-inducible factor 1α,HIF-1α)基因,观察缺氧处理后人羊膜间充质干细胞(human amniotic mesenchymal stem cells,hAMSCs)成活及凋亡情况,探讨 HIF-1α 对 hAMSCs 耐受缺氧能力的影响。方法取健康剖宫产产妇自愿捐赠的羊膜组织分离、培养 hAMSCs,通过倒置相差显微镜观察细胞形态及免疫荧光法检测干细胞标志物 OCT-4、NANOG 表达,对培养细胞进行鉴定。取第 3 代 hAMSCs 进行缺氧处理(200 μmol/L CoCl2)后,按以下分组瞬时转染对应质粒:A 组为 hAMSCs 空白组,B 组为 pcDNA3.1 阴性对照组,C 组为 shRNA 阴性对照组,D 组为 shRNA-HIF-1α 干扰组,E 组为 pcDNA3.1-HIF-1α 过表达组。缺氧处理后 12、24、48 h 采用细胞计数试剂盒 8(cell counting kit 8,CCK-8)检测各组细胞成活率;24 h 采用流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,并采用 Western blot 检测 HIF-1α、VEGF、B 细胞淋巴瘤 2(B-cell lymphoma 2,Bcl-2)、Bax、活化型半胱天冬酶-3(cleaved Caspase-3,C-Caspase-3)蛋白表达。结果CCK-8 法检测示,缺氧处理后各时间点与 A、C 组比较,D 组细胞成活率明显降低(P<0.05);与 A、B 组比较,E 组细胞成活率明显升高,其中 24 h 组间比较差异有统计学意义(P<0.05);E 组内 24 h 时细胞成活率明显高于 12、48 h 时(P<0.05)。流式细胞仪检测示,与 A、C 组比较,D 组细胞凋亡率明显升高(P<0.05);与 A、B 组比较,E 组细胞凋亡率明显降低(P<0.05)。Western blot 检测示,与 A、C 组比较,D 组细胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表达明显减少,Bax、C-Caspase-3 蛋白表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05);而 E 组结果相反,与 A、B 组比较,E 组细胞中 HIF-1α、VEGF、Bcl-2 蛋白表达明显增加,Bax、C-Caspase-3 蛋白表达明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论HIF-1α 基因过表达能够明显改善 hAMSCs 耐受缺氧能力,其机制可能与上调 VEGF 和 Bcl-2 表达及下调 Bax 和 C-Caspase-3 表达作用相关。

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